معلومة

أعداد نسخ منخفضة من البلازميدات


لدي بلازميد من أصل P15A والذي يبدو أنه يحتوي على عدد نسخ منخفض (انظر هنا). هذا من شأنه أن يفسر سبب انخفاض معدلات التنقية للهضم اللاحق (يُظهر الجل البلازميد بعد الهضم والتنظيف مع تحميل 5 ميكرولتر). أقوم حاليًا بزراعة الإشريكية القولونية التي تحتوي على البلازميد في 5 مل بين عشية وضحاها قبل القيام بعمل صغير. سؤالي هو هل يجب أن أقوم بتنمية ثقافات 5 مل الخاصة بي لمدة أطول (يومين) أم مجرد التخلي عنها والقيام بكمية أكبر من أجل Midiprep.

كما أنني أشعر بالفضول لمعرفة ما الذي يتحكم بالفعل في عدد نسخة البلازميد داخل الخلايا. سيكون تفسير تنظيم عدد نسخة البلازميد موضع تقدير كبير.


  • أنا متأكد من أنك فعلت ذلك ؛ مجرد ملاحظة للآخرين: قم بعمل شاشة PCR للتأكد من وجود البلازميد.
  • بالنسبة للأجهزة الصغيرة ، فأنت لا تحتاج عمومًا إلى ثقافة بادئ.
  • إذا كنت قد قمت بفحص الحيوانات المستنسخة وتريد الآن فقط تضخيم البلازميد والاحتفاظ به لأغراض الاستنساخ ، فانتقل إلى maxiprep مع 200-400 مل من الثقافات.
  • لا تفرط في نمو الخلايا ، يصبح الاستخراج صعبًا وستحصل على عوائد أسوأ. ما عليك سوى إنشاء ثقافة ضخمة وتجميع الخلايا قبل الاستخراج. قم دائمًا ببذر وحصاد الخلايا الموجودة في مرحلة النمو الأسي.
  • إذا كنت بحاجة إلى فحص البلازميد بحثًا عن الحيوانات المستنسخة أو شيء ما ، فقم بإجراء عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة ، واحتفظ بالمستعمرة محصنة في مزرعة صغيرة (اصنع مخزونًا مؤقتًا من الجلسرين إذا كان الفحص يستغرق وقتًا). إذا كانت الشاشة إيجابية ، فقم بغرس ثقافة المبتدئين لثقافة maxiprep / gigaprep مع هذا المخزون.

تعزيز إنتاجية عدد النسخ المنخفضة من E. coli Plasmids عن طريق تحسين وسائط نمو الخلايا

يشيع استخدام البلازميد minipreps لتنقية DNA البلازميد الدائري من الثقافات الصغيرة للخلايا البكتيرية. تنتج البلازميدات ذات عدد النسخ المرتفع عوائد عالية من الحمض النووي باستخدام هذا الإجراء. ومع ذلك ، فإن المحضرات الأولية للبلازميدات ذات النسخ المنخفضة والمفردة تؤدي إلى عيار منخفض من الحمض النووي المرغوب فيه وأحيانًا تكون مصحوبة بدنا كروموسومي غير مرغوب فيه. أظهر العمل السابق الذي تم إجراؤه في هذا المعمل أن استخدام Terrific Broth (TB) لتنمية خلايا E. coli قد حسن إنتاج البلازميد DNA بالنسبة لمرق Lysogeny (LB) والعديد من المرق الأخرى الشائعة الاستخدام. يحتوي السل على محلول فوسفات الجلسرين والبوتاسيوم غير موجود في LB ، ويحتوي أيضًا على خمسة أضعاف خلاصة الخميرة. والمثير للدهشة أن إنتاج البلازميد المرتفع مع مرض السل لم يكن بسبب وجود الجلسرين أو التخزين المؤقت. تتمثل الأهداف الرئيسية للدراسة الحالية في تحديد المكونات الدقيقة في السل التي تجعله مرقًا ممتازًا وتطوير طرق جديدة لتحسين إنتاجية النسخ المنخفضة والبلازميدات أحادية النسخ المعزولة من minipreps. حاولت التجارب الأولية تحديد ما إذا كانت زيادة كمية مستخلص الخميرة في LB يمكن أن تجعلها معادلة لمرض السل أو تفوقه. أجريت تحضيرات البلازميد مع زيادة التركيزات التكميلية لمستخلص الخميرة في مرق LB (LBX) e ، ومقارنتها مع إنتاجية المحضرات التي تم إجراؤها باستخدام مرق LB و TB التقليدي. تمت مراقبة كثافة الخلايا باستخدام قياسات OD550 ، واستخدمت المواد الهلامية من الاغاروز وقياس التألق بالحمض النووي لتحديد كفاءة بروتوكولات الإعداد باستخدام مرق LBX. وجد أن الكميات العالية من خلاصة الخميرة تزيد من كثافة الخلايا وإنتاج الحمض النووي بطريقة تعتمد على الجرعة. تشير النتائج إلى أن تفوق السل يرجع إلى محتواه من خلاصة الخميرة وليس المكونات الإضافية التي تميز المرق عن LB. يتم إجراء تجارب إضافية لمحاولة تحسين إنتاجية الحمض النووي بشكل أكبر ولتحديد ما إذا كان استخدام هذا المرق أثناء تحويل الحمض النووي إلى خلايا الإشريكية القولونية يمكن أن يولد أيضًا كفاءة أعلى.

شكر (شكر) الممول: المعاهد الوطنية للصحة ، مؤسسة روبرت أ. ويلش ، تحالف هيوستن لويس ستوكس للمشاركين من الأقليات


تعزيز غلة عدد النسخ المنخفضة والمفردة من DNA البلازميد من خلايا الإشريكية القولونية

العديد من البلازميدات المستخدمة في استنساخ الجينات وتعبير البروتين غير المتجانسة في خلايا الإشريكية القولونية هي عبارة عن عدد نسخ منخفض أو بلازميدات ذات رقم نسخة واحدة. ينتج عن استخراج هذه الأنواع من البلازميدات من مزارع الخلايا البكتيرية الصغيرة إنتاجية منخفضة من الحمض النووي. في هذه الدراسة ، قمنا بتحديد كمية إنتاجية DNA البلازميد ذات النسخ المنخفضة وعدد النسخ الفردية بعد نمو الخلايا في أربعة مرق مستخدمة على نطاق واسع (SB و SOC و TB و 2 xYT) وقارننا النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام LB ، وهي E. وسط نمو الخلايا القولونية. ينتج TB (المرق الرائع) باستمرار أكبر قدر من DNA البلازميد ، بالاتفاق مع قدرته على إنتاج عيارات خلية أعلى. يعود تفوق السل في المقام الأول إلى المستويات العالية من مستخلص الخميرة (24 جم / لتر) وكان مستقلاً عن الجلسرين ، وهو مكون فريد لهذا المرق. ومن المثير للاهتمام ، أن تحضير LB بمستويات عالية مماثلة من مستخلص الخميرة (مرق LB24) أدى إلى إنتاج بلازميد مكافئ لتلك الخاصة بمرض السل. على النقيض من ذلك ، فإن زيادة تركيز الأمبيسيلين لتعزيز احتباس البلازميد لم يحسن استعادة DNA البلازميد. توضح هذه التجارب أنه يمكن تحسين إنتاجية الحمض النووي البلازميدي ذي النسخ المنخفضة والمفردة من minipreps باستخدام وسائط بسيطة وغير مكلفة.

الكلمات الدالة: عدد النسخ تنقية الحمض النووي LB Miniprep Plasmid TB.


مشكلة التقسيم

يحدث عدم توافق البلازميد أيضًا بسبب تقسيم البلازميد (شوماخر ، 2012). هذا المفهوم أكثر تعقيدًا بقليل من التنافس ببساطة على عوامل التحكم في النسخ المتماثل ويميل إلى أن يكون مصدر قلق أكبر مع بلازميدات النسخ المنخفضة ، على الرغم من أن مشكلة التقسيم تحدث في بلازميدات النسخ العالية (دياز وآخرون ، 2015). تحتوي البلازميدات على نظام لتقسيم نفسها إلى كل خلية ابنة أثناء انقسام الخلية. إنهم لا يعتمدون ببساطة على الصدفة (أو الانتشار العشوائي) لتحقيق ذلك.

توجد عدة إصدارات مختلفة من نظام تقسيم البلازميد في البكتيريا ، ولكنها تتكون عمومًا من منطقة تشبه السنترومير على البلازميد ، وبروتين ربط منطقة تشبه السنترومير (CBP) ، وقسم NTPase (شوماخر ، 2012). أثناء الانقسام الخلوي ، ترتبط CBPs بالمنطقة التي تشبه السنترومير على كل بلازميد وتقرن البلازميدات معًا (على غرار الكروماتيدات الشقيقة التي تجتمع معًا في الخلايا حقيقية النواة). يتم تجنيد قسم NTPase و "يمشي" كل بلازميد إلى خلية ابنة منفصلة. عندما تكون البلازميدات متوافقة ، ترتبط CBPs المختلفة بكل نوع بلازميد ، وتفصل NTPases المختلفة أزواج البلازميد في الخلايا الوليدة الجديدة.

بالنسبة للبلازميدات عالية النسخ ، فإن عدم التوافق بسبب التقسيم مشابه لعدم التوافق بسبب وجود نفس آلية النسخ المتماثل. تتنافس البلازميدات عالية النسخ مع نفس منطقة الربط الشبيهة بالوسط على نفس CBPs و NTPase لتقسيم البلازميدات بشكل صحيح إلى كل خلية ابنة. عندما لا يكون هناك ما يكفي من CBPs و NTPase للالتفاف ، يتم وضع البلازميدات بشكل عشوائي ، مما يؤدي إلى فقدان البلازميد (Diaz et al. ، 2015).

الشكل 2: مشكلة التقسيم.

بالنسبة لبلازميدات النسخ المنخفضة ، ترجع النظرية الرئيسية لعدم توافق البلازميد إلى مشكلة تحديد الهوية: لا تستطيع CBPs في الخلية معرفة الفرق بين البلازميدات إذا كان لديهم نفس المنطقة الشبيهة بالوسط ، وينتهي الأمر بـ NTPases "المشي" في نفس البلازميدات إلى خلية ابنة واحدة ، بدلاً من تقسيم كل نوع من أنواع البلازميد إلى خلايا ابنة منفصلة (الشكل 2) (Ebersbach et al. ، 2005). ومع ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أن النسخ المتماثل المتأخر الذي يحدث لبعض أنواع البلازميدات منخفضة النسخ أثناء انقسام الخلية لا يتيح ببساطة وقتًا كافيًا لحدوث التقسيم الصحيح (Diaz et al. ، 2015).

تجدر الإشارة أيضًا إلى أن البلازميدات يمكن أن تكون غير متوافقة بشكل متماثل ، مما يعني أن كلا البلازميدات تضيع من الخلية بنفس الاحتمال ، أو غير متماثل ، حيث يفقد بلازميد واحد من الخلية بمعدل أعلى من البلازميد المقيم. يحدث فقدان البلازميد غير المتماثل لعدة أسباب ، بما في ذلك أحد البلازميد الذي يحجب النسخ المتماثل لآخر والبلازميد يتفوق على البلازميد الآخر من أجل النسخ أو التقسيم (نوفيك ، 1987). في الحالات التي يتفوق فيها أحد البلازميد على الآخر ، عادةً ما يمكن لبلازميد نسخة أصغر وأعلى أن يعاير بشكل أكثر فاعلية النسخ المتماثل أو آلية التقسيم بعيدًا عن بلازميد نسخة أكبر ومنخفضة ، ومن المرجح أن يتم فقد بلازميد النسخة الأكبر والأقل بمرور الوقت.


2. متى يكون رقم النسخة العالية جيدًا؟

  • تعبير البروتين: على الرغم من أنه لا يبدو أن هناك ميزة كبيرة لاستخدام بلازميدات ذات عدد نسخ أعلى من النواقل المستندة إلى pBR322 من حيث إنتاجية البروتين ، فقد يكون البلازميد ذو النسخ العالية هو منفذ الاتصال الأول إذا واجهت عوائد منخفضة من البروتين. ضع في اعتبارك أن عدد النسخ المرتفع جدًا يمكن أن يؤدي إلى تراكم البروتين وتعديل ناقص بعد الترجمة ، ربما لأن العبء الأيضي مرتفع للغاية.
  • استنساخ: سيؤدي استخدام بلازميد عالي النسخ عمومًا إلى إنتاجية أكبر من محضرات البلازميد.

متى يكون رقم النسخة الأقل جيدًا؟

  • التعبير عن منتج سام: لنفترض أنك تريد دراسة بروتين فطري لخصائصه المضادة للبكتيريا وتريد التعبير عنه في البكتيريا. قد تكون النسخة المنخفضة أفضل لتقليل التأثيرات السامة ولتجنب قتل الثقافات البكتيرية!
  • دراسات المسوخ: لقد قمت بتغيير إنزيم الفائدة الخاص بك. الآن تريد مقارنة نشاطه بالأنزيم من النوع البري في سياق فسيولوجي (أي تحويله إلى خلايا مضيفة أصلية). لزيادة فرص القياسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية و / أو التقييم في الجسم الحي الأنماط الظاهرية ، التعبير ذو المستوى المنخفض من نسخة واحدة عادة ما يكون خيارًا أفضل. قد تولد البروتينات المفرطة التعبير أنماطًا ظاهرية اصطناعية وتفاعلات بروتينية خاطئة ومشكلات هيكلية داخل البروتين نفسه ، مما يؤدي إلى نتائج مربكة وغير موثوقة. (نعلم جميعًا أن النتائج يمكن أن تكون مربكة بما يكفي من تلقاء نفسها دون مزيد من التعقيد!)

بناء البلازميدات بأرقام نسخ قابلة للضبط بتنسيق خميرة الخميرة وتطبيقاتها في تحسين المسار وتكامل الجينوم المتعدد

تم استخدام البلازميدات منخفضة النسخ المستندة إلى CEN / ARS والبلازميدات عالية النسخ المستندة إلى 2 ميكرومتر على نطاق واسع لكل من الدراسات الأساسية والتطبيقات العملية في خميرة الخميرة. ومع ذلك ، فإن أرقام النسخ المنخفضة نسبيًا والنطاق الديناميكي الضيق يحد من تطبيقاتها في كثير من الحالات. في هذه الدراسة ، تم تصميم مستوى التعبير عن بروتينات علامة الاختيار لزيادة عدد نسخ البلازميد. تم إنشاء سلسلة من البلازميدات ذات أعداد نسخ متزايدة تدريجية. أظهر عدد نسخ البلازميدات ذات الواسمات المهيمنة المهندسة (5-100 نسخة لكل خلية) علاقة إيجابية مع تركيز المضادات الحيوية المكملة لوسائط النمو. بناءً على هذه النتيجة ، قمنا بتطوير إستراتيجية بسيطة لكنها عالية الكفاءة ، تسمى تحسين المسار عن طريق ضبط تركيزات المضادات الحيوية (POTAC) لتحقيق التوازن السريع في تدفق المسارات متعددة الجينات على مستوى الحمض النووي في S. cerevisiae. كدليل على المفهوم ، تم استخدام POTAC لتحسين الليكوبين و ن- مسارات التخليق الحيوي للبوتانول ، وزيادة إنتاج الليكوبين و ن- البوتانول بنسبة 10 و 100 ضعف على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تمت محاولة تكامل الجينوم متعدد الإرسال مع أرقام النسخ التي يمكن التحكم فيها من خلال الجمع بين العلامات المهيمنة الهندسية مع نظام CRISPR / Cas9. التكنولوجيا الحيوية. بيونج. 2016113: 2462-2473. © 2016 Wiley Periodicals، Inc.

يمكن العثور على معلومات إضافية داعمة في النسخة الموجودة على الإنترنت من هذه المقالة على موقع الويب الخاص بالناشر.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


خصائص البلازميدات والبكتيريا

البلازميدات هي عناصر DNA خارج الصبغية تحافظ على نسبة مهمة من الجينوم الكلي والجين الضروريين لتوسيع الخلية. تميل البلازميدات إلى أن تكون دائرية ، ومع ذلك ، فإن الكثير منها خطي ، وقد يكون لها بنية DNA فائقة الالتواء والتي تخضع لعملية الالتفاف السفلي لخيوط الحمض النووي من أجل ضغط جزيئات الحمض النووي. علاوة على ذلك ، يمكن أيضًا تصنيف البلازميدات إلى مجموعتين: البلازميدات ذات عدد النسخ المنخفض والبلازميدات ذات العدد الاحتياطي العالي. على سبيل المثال ، F plasmid المعروف أيضًا باسم بلازميد الخصوبة هو بلازميد ذو عدد نسخ منخفض ، ويكشف كنسخة واحدة في الخلية ، وقد حدث التقسيم الإنتاجي بدلاً من التوزيع العشوائي بهدف تثبيت البلازميد في قسم الخلية. بعد قسم الخلية من البلازميد F ، انتهى الأمر بالحصول على نسختين لكل دورة. العقيد E1 عبارة عن بلازميد بكمية عالية من النسخ ، في قسم الخلايا ، تداول عشوائي بين خليتي جلد أميرة مما ينتج عنه نسخة واحدة على الأقل من البلازميد الموجود في كل خلية. يُقال أن التقسيم الصحيح عند انقسام الخلية أمر حيوي لأن التقسيم الخاطئ يؤدي إلى فصل البلازميد.

عند مقارنة البلازميد مع الحمض النووي الكروموسومي ، يكون البلازميد أصغر من الحمض النووي الكروموسومي ، وحتى أكبر بلازميد يكون أيضًا أصغر من الحمض النووي الصبغي. وبالتالي ، عند تشغيل هلام الاغاروز ، فإن البلازميد سوف يعمل بشكل أسرع ويتم العثور عليه قبل الكروموسومات. على الرغم من وجود ظرف واحد أن البلازميد سيكون أكبر من الحمض النووي الكروموسومي هو أن الحمض النووي الكروموسومي يتشقق إلى أجزاء خطية قصيرة بينما لا يزال البلازميد كجزيء دائري سليم. عادة ما تكون البلازميدات عبارة عن جزيئات صغيرة يبلغ طولها بضعة كيلوبات ، ومع ذلك ، فإن العديد من البلازميدات حصريًا من جنس Pseudomonas لها عدة مئات من الكيلوبات الطويلة. ColE1 وهو النموذج الأولي للإشريكية القولونية ، وهو بلازميد صغير بحجم 6. 4 كيلو بايت غالبًا ما يستخدم كناقل استنساخ للتحكم جزئيًا في تكاثر البلازميد. كما هو مذكور أعلاه ، فإن ColE1 هو رقم نسخة أعلى بلازميد ، لذلك تكون الخلية التي تحتوي على هذا البلازميد صغيرة عادةً. تنتج كمية النسخ العالية من البلازميد نسخًا متعددة داخل الخلية مما يزيد من كمية الطاقة الخلوية المطلوبة لتكرار وظهور البلازميدات ، مما يؤدي إلى الحمل الأيضي وإضعاف الأداء الخلوي الطبيعي. عواقب زيادة الحمل الأيضي هي فقدان البلازميد المؤتلف أو الجين المؤتلف من البلازميد. ColE1 غير مقترن ، فهو غير قادر على نقل نفسه في خلية إلى أخرى لأن البلازميد صغير.

البلازميد F عبارة عن بلازميد ضخم يبلغ طوله حوالي 100 كيلو بايت ، لذلك حدث الاقتران ، حيث يتم نقل 30 كيلو بايت من 100 كيلو بايت من واحد إلى آخر. يحتوي هذا البلازميد على تسعة تكرارات من متواليات 17 نقطة أساس تسمى interons والتي يرتبط بها بروتين RepA الضروري لتطبيق السوق.

يمكن تحديد بعض الخصائص البكتيرية عن طريق البلازميدات مثل مستوى مقاومة المضادات الحيوية ، والكوليسين والبكتريوسينات ، ومحددات الفوعة ، والبلازميدات في البكتيريا المرتبطة بالنبات والأنشطة الأيضية. إن مقدار مقاومة المضادات الحيوية هو الطريقة الأكثر ملاءمة لوصف البكتيريا. تصبح البكتيريا محصنة ضد المضادات الحيوية من خلال تبني البلازميد الذي يشفر بجين مضاد حيوي في بكتيريا إلى أخرى. من ناحية أخرى ، فإن البكتيريا التي تتضمن القدرة على مقاومة بعض الأدوية مثل محلول حمض الناليدوك والريفامبسين هي نتيجة طفرة في الجين الذي يحكم البروتين المستهدف. بعض البكتيريا ليست فقط مقاومة لمضاد حيوي واحد ولكن مستوى المقاومة للعديد من المضادات الحيوية في نفس الوقت إما أنها حصلت على العديد من البلازميدات العاملين لحسابهم الخاص في خلية أو تمتلك بلازميدًا منفردًا مع العديد من محددات المقاومة عليه. على سبيل المثال ، عندما يتم نقل البكتيريا التي تحتوي على البلازميدات المشفرة لجين kanr المعروف أيضًا باسم مستوى kanamycin لجين المقاومة إلى وسيط يحتوي على مضادات حيوية من kanamycin ، حيث تقاوم البكتيريا الكاناميسين ، بعد فترة حضانة معينة ، فإنها تبقى على قيد الحياة ويتم ملاحظة المستعمرات في الوسط. .

تكون البلازميدات قادرة على إنتاج بروتينات صحية مثل الكوليسين والبكتريوسينات التي لها تأثير مضاد للميكروبات ضد الكائنات الحية ذات الصلة بعناية. أخذ ColE1 جينًا يسمى Colicinogenic لتخليق colicins E1 وجينات أخرى لمنح مناعة لعمل الكولسين ليكون قادرًا على حماية الخلية من التداعيات المميتة لمنتجها. تعتبر كوليسينات التي تطلق في البيئة سامة لبعض سلالات الإشريكية القولونية ويمكن أن تقلل المنافسة من سلالات الإشريكية القولونية الأخرى.

يمكن أن تحمل البلازميدات أنواعًا من الجينات الخطرة الضرورية للفوعة. يحتوي بلازميد الإشريكية القولونية على جين يسمى جين السم المتحول أو الجين LT الذي ينتج سمًا متقلبًا يرتبط ارتباطًا وثيقًا بسم الكوليرا. وهكذا ، فإن البلازميدات المكونة من جينات LT لديها القدرة على أن تشبه الكوليرا وتسبب المرض. مثال آخر هو 70 كيلو بايت من بلازميد الفوعة لأنواع يرسينيا وخاصة Yersinia pestis التي هي الكائنات الحية الدقيقة المسببة للطاعون. تصنع هذه البلازميدات البروتينات وتهاجم استجابة مناعة الخلايا من أجل تعطيل اتصال الخلايا أو القضاء على خلايا الجلد في أجسامنا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بكتيريا الجمرة الخبيثة Bacillus anthracis ، والتي تسبب الجمرة الخبيثة ، تحتوي على نوعين من البلازميدات الكبيرة المعروفة باسم POX1 و POX2. يشفر بلازميد pOX1 الجينات التي تصنع سم الجمرة الخبيثة و pOX2 يشفر الجينات التي تصنع الكبسولة لحماية البكتيريا من الاستجابة المناعية. يؤدي غياب POX1 وبقاء POX2 في خلايا الجلد إلى فقدان الضراوة ، وقد يصبح حدوث POX1 وعدم كفاية POX2 مثل الإجهاد Sterne استخدامًا طبيًا كلقاح حي موهن للماشية. لا تحتوي أنواع العصيات مثل Bacillus cereus و Bacillus thuringiensis على سلالات الجمرة الخبيثة ، وبالتالي فإن هذه البكتيريا التي تحتوي على بلازميدات الفوعة pOX1 و pOX2 يمكن أن تسبب فقط مشاكل صحية تشبه الجمرة الخبيثة مثل المشكلات الصحية الخفيفة التي تنقلها الأغذية.

السمة الأخرى للبكتيريا هي الإمراضية. ترتبط الإمراضية بنقل DNA البلازميد المحدد من بلازميدات Ti الخاصة بالبكتيريا الأجرعية إلى الخلايا النباتية ، وتحفز هذه البلازميد Ti بشكل خاص نموًا شبيهًا بالورم يسمى مرارة التاج في عدد قليل من النباتات. تتمتع أنواع جنس Rhizobium بشراكة تكافلية مع المحاصيل ، فهي تثبت النيتروجين في مصدر قابل للاستخدام للنيتروجين المنخفض للزهرة عن طريق تكوين عقيدات على جذور المحاصيل البقولية.

يتم التلاعب بجزء من الأنشطة الأيضية بواسطة البلازميدات ، على سبيل المثال ، البلازميد الذي يحتوي على جينات تخمير اللاكتوز الذي تم كشف النقاب عنه في توتر غير مخمر ، سيكون لديه القدرة على العمل مع اللاكتوز. يسبب نقص اللاكتوز في تخمير اللاكتوز في جنس السالمونيلا انتظار العدوى ، بسبب احتياجات بلازميد تخمير اللاكتوز للوكالات المسببة للسالمونيلا. لا تحتوي البلازميدات على الجينات الخاصة بتخمير اللاكتوز فحسب ، بل تمتلك أيضًا جينات تخمير السكر الأخرى مثل السكروز ، والتحلل المائي لليوريا ، وإنتاج كبريتيد الهيدروجين ، والقدرة على تحلل المواد الكيميائية الضارة المحتملة والأنشطة الأيضية الأخرى. بلازميد pWWO من Pseudomonas putida هو بلازميد يتوسط النشاط الأيضي لتحلل المواد الكيميائية الضارة. في المسار الأعلى ، يحتوي pWWO على بعض الإنزيمات التي تحول الهيدروكربونات الحلقية مثل التولوين والزيلين إلى بنزوات وتحلل البنزوات إلى الكاتيكول ، داخل المسار السفلي ، يتحلل الكاتيكول الوسيط إلى وسيط استقلابي لإنتاج الطاقة والتخليق الحيوي عبر انقسام حلقة الارتباط لـ كاتيكول. إن إنزيمات المسار العلوي متخصصة ، والبلازميدات المختلفة لها خصائص مختلفة ، والبلازميدات الأخرى التي تتحلل بوساطة تشمل النفثالين ، وحموضة ثنائي كلورو فينوكسي أسيتيك ، والكافور والمركبات العطرية المكلورة مثل 3-chlorobenzoate. المعالجة البيولوجية هي تقنية إدارة معالجة سوء الاستخدام والتي تستخدم كائنات دقيقة تظهر بوضوح لتنظيف المواقع الملوثة. يتم استخدام الكائنات الحية الدقيقة التي تحتوي على الهيدروكربونات الحلقية كمصدر وحيد للكربون لتقليل الملوثات العضوية والطبيعية في تربة الحدائق والمياه الجوفية والحمأة والمواد الصلبة.

تميل البلازميدات إلى الخسارة من خلال الطفرة بمعدل أعلى من المجتمع ، والبلازميد النامي يكون مستقرًا بشكل طبيعي ومن الأفضل العثور عليه لعزل إجهاد محدد بينما لا يمكن التنبؤ بالبلازميد المصطنع عادةً ويصعب العثور عليه. تعتبر البلازميدات غير المتوقعة مشكلة مكلفة ومزعجة في الاستخدام المهني حيث يمكن أن تضيع بسهولة أثناء عملية الإنشاء. يرتبط عدم استقرار البلازميدات بوضوح بسلامة البلازميد ومعدلات النمو التفاضلية والتقسيم عند انقسام الخلية.

تشير سلامة البلازميد إلى الاحتفاظ بهيكل البلازميد ، حيث تحتوي البلازميدات التي تحدث على نقاط ساخنة لإعادة التركيب مما يجعل البلازميد لديه خيارات ليصبح غير مستقر وخاسر للجينات. يمكن أن يؤدي إعادة التركيب بين التسلسلات المتكررة مثل الينقولات أو تسلسلات الإدراج إلى حذف الجينات أو عكسها. لتكون قادرًا على تحديد حذف الجين في البلازميد ، يمكن استخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لتحديد حجم البلازميد أو الماصات في وسيط مكون من المضادات الحيوية المحددة لاختبار كمية البلازميدات المقاومة للمضادات الحيوية. تحديد البلازميدات التي تمر عبر الانقلاب أكثر صعوبة من الحذف في البلازميد لأن البلازميدات لا تغير أحجامها وربما تظل الخصائص المظهرية الأصلية ، لذلك قد تكون هناك طريقة واحدة للتعرف على وجود الانقلاب ، وهي عن طريق التسلسل البلازميد.

هناك فرق ملحوظ في معدل التقدم بين الخلايا التي تنتج البلازميد بشكل لا يمكن التنبؤ به أو ينتج عنه التخلص من البلازميد. أثناء استخدام معدل تقدم عالٍ ، سيزداد الوزن الأيضي الناتج عن تكرار البلازميدات ومظاهر الجينات وسيكون تحدي عدم الاستقرار أكثر أهمية.

التقسيم الصحيح مهم لأن فشل التقسيم سيؤدي إلى زيادة نسبة خلايا الجلد الخالية من البلازميد أو القضاء على خلايا الجلد. تختار البلازميدات ذات كمية النسخ العالية امتلاك تقسيم عشوائي بينما تختار البلازميدات ذات العدد الاحتياطي المنخفض امتلاك تجزئة نشطة ، يتم التلاعب بعدد نسخة البلازميد عن طريق حساب عدد منطقة النسخ بدلاً من عدد المواد. سيكون للبلازميد رقم احتياطي كبير إنشاءات متعددة أو إعادة تركيب بين المونومر لعملية النسخ المتماثل لأن المالتيمرات المتعددة تطرح أكثر من أصل واحد للنسخ المتماثل. يُذكر أنه البلازميدات لأن multimers ليست فعالة جدًا للحفاظ على كل خلية ابنة يمكن أن تتلقى نسخة مكررة من البلازميد من المونومرات أو الثنائيات أو التشذيب أثناء قسم الخلية. لتكون قادرًا على تثبيت البلازميد ، تم استخدام إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، على سبيل المثال ، يحتوي ColE1 على موقع متخصص من cer وهو هدف لعمل بروتينات مضيف الويب تسمى XerC و XerD. عندما يحتاج ثنائى البلازميد الذي يحتوي على نسختين من مجموعة cer إلى الاعتناء بمونومرين ، فإن XerC و XerD سيشغلان إعادة تركيب موقع محدد بينهما ، وعبورهما وكسر كلتا المادتين ، وإعادة ضمهما مرة أخرى. دقة الصورة للبلازميدات ثنائية الأبعاد أو البلازميدات المتعددة في بلازميد أحادي تعمل على استقرار البلازميدات في قسم الخلية.

إن عملية التخلص من الفصل بعد الفصل هي عملية القضاء على أي خلايا فقدت البلازميد والتي يتطلب التخلص منها جيني بلازميد ، أحدهما يحدد عوامل سامة طويلة الأمد ومتوازنة بشكل جيد والآخر يحدد ترياق غير مستقر لمنع التأثير المميت. عمل السم. عادة ما يكون السم بروتينًا ضروريًا بينما يكون الترياق عبارة عن حمض نووي ريبوزي مضاد للتربة يمنع ترجمة البروتينات السامة. على سبيل المثال ، يحتوي البلازميد F على أوبرا يشفر جينين ، وهناك CcdA الذي يعمل بمثابة ترياق و CcdB الذي يعمل على السم. تعمل بروتينات CcdB على إعاقة تكرار الحمض النووي عن طريق التداخل على DNA gyrase بوساطة الالتفاف الفائق حيث يقوم CcdA بتحييد سمية CcB ، بمجرد أن تتحلل أو تتلف جميع CcdA التي لا يمكن التنبؤ بها ، لم يعد CcdB أكثر ثباتًا أكثر تحييدًا وأخيراً يتم القضاء على الخلية. على سبيل المثال ، يتضمن البلازميد R1 جينين: هوك و سوك. العامل الضار هو hok الذي يتدخل في غشاء الخلية مثل sok ، وهو جزيء RNA مضاد للتأثير لقمع الاستئصال عن طريق الارتباط بنفس منطقة hok ولكن يتم نسخه في الاتجاه المعاكس. بمجرد أن يرتبط الحمض النووي الريبي sok المضاد للاندماج بـ hok RNA ، يتم تجنب الترجمة ، وبالتالي في حالة فقدان بلازميد R1 ، يتحلل جزيء sok RNA غير المتوقع بسرعة ، في الفصل الخالي من البلازميد ، يتم ترجمة جزيء hok RNA المستقر ويساهم في إماتة زنزانة. قد تكون هناك مزايا وعيوب للتخلص من الفصل العنصري ، والعيب هو موت خلايا الجلد والفائدة هي أنه إذا كانت خلايا الجلد تحت حالة الجوع ، فإن موت بعض الخلايا يمكن أن يساعد في تعزيز نجاح الخلايا المتبقية.

جيريمي دبليو دي وسيمون ف. (2010) علم الوراثة الجزيئية للبكتيريا. الطبعة الخامسة. ، أمريكا: John Wiley & Sons، Ltd.


نواقل الاستنساخ: الأنواع & # 038 الخصائص

المتجه هو جزيء DNA يستخدم لنقل الحمض النووي الخارجي إلى الخلية المضيفة. المتجه قادر على التكرار الذاتي والتكامل المستقر داخل الخلية المضيفة.

أصبح التحليل الجزيئي للحمض النووي ممكنا فقط بعد اكتشاف النواقل. تتضمن العملية الكاملة للاستنساخ الجزيئي الخطوات التالية:

  1. هضم شظايا الحمض النووي للجزء المستهدف والحمض النووي المتجه بمساعدة إنزيمات التقييد ،
  2. ربط الجزء المستهدف بالحمض النووي المتجه بمساعدة ligases DNA ، و
  3. إدخال المقطع المرتبط في الخلية المضيفة للتكاثر.

الخصائص العامة للناقل:

  • يجب أن يكون له أصل النسخ المتماثل ، المعروف باسم ori ، بحيث يكون المتجه قادرًا على التكرار الذاتي داخل الكائن الحي المضيف.
  • يجب أن تمتلك موقع تقييد متوافق لإدخال جزيء الحمض النووي.
  • يجب أن يكون للناقل دائمًا علامة يمكن تحديدها لفحص الكائن المؤتلف. يمكن أن تكون هذه العلامة القابلة للتحديد مورثة مقاومة للمضادات الحيوية.
  • لسهولة الاندماج في الماكينة المضيفة ، يجب أن يكون المتجه نفسه صغير الحجم وأن يكون قادرًا على دمج الحجم الكبير للإدراج.

ناقل الاستنساخ

ناقل الاستنساخ هو أيضًا جزء من الحمض النووي القادر على التكرار الذاتي والحفاظ المستقر داخل الكائن الحي المضيف. يمكن استخلاصه من فيروس أو بلازميد أو خلايا كائن حي أعلى. معظم نواقل الاستنساخ معدلة وراثيا. يتم اختياره بناءً على حجم ونوع قطعة الحمض النووي المراد استنساخها.

يجب أن تمتلك نواقل الاستنساخ الخصائص العامة التالية:

  • يجب أن تكون صغيرة الحجم.
  • يجب أن يكون له أصل النسخ المتماثل.
  • يجب أن يكون أيضًا متوافقًا مع الكائن الحي المضيف.
  • يجب أن تمتلك موقع تقييد.
  • يجب ألا يتدخل إدخال جزء المانح في خاصية التكرار الذاتي لمتجه الاستنساخ.
  • يجب أن يكون هناك واسم قابل للتحديد ، ربما يكون جينًا مقاومًا للمضادات الحيوية ، لفحص الخلايا المؤتلفة.
  • يجب أن تكون قادرة على العمل تحت نظام بدائية النواة وكذلك نظام حقيقيات النوى.
  • يجب أن تكون مواقع الاستنساخ المتعددة موجودة.

أهمية نواقل الاستنساخ

تستخدم نواقل الاستنساخ كوسيلة لنقل المواد الوراثية الأجنبية إلى خلية أخرى. يتم تكرار هذا الجزء الأجنبي من الحمض النووي والتعبير عنه باستخدام آلية الكائن الحي المضيف.

يسهل ناقل الاستنساخ تضخيم نسخة واحدة من جزيء DNA إلى عدة نسخ. يعد استنساخ الجينات الجزيئي أمرًا صعبًا بدون استخدام نواقل الاستنساخ.

تاريخ نواقل الاستنساخ

كان هربرت بوير وكيتشي إيتاكورا وآرثر ريجز ثلاثة علماء يعملون في مختبر بوير بجامعة كاليفورنيا ، حيث تعرفوا على ناقل عام للاستنساخ. يحتوي ناقل الاستنساخ هذا على مواقع تقييد لاستنساخ الحمض النووي الأجنبي وأيضًا التعبير عن جينات مقاومة المضادات الحيوية لفحص الخلايا المؤتلفة / المحولة. كان أول ناقل يستخدم لأغراض الاستنساخ هو pBR322 ، وهو بلازميد. كان صغير الحجم ، ما يقرب من 4 كيلوبايت ، وكان له علامتان يمكن اختيارهما.

ميزات نواقل الاستنساخ

1. أصل النسخ المتماثل (ORI)

  • مجموعة / تسلسل محدد من النيوكليوتيدات حيث يبدأ النسخ المتماثل.
  • للنسخ المتماثل داخل الخلية المضيفة.
  • يبدأ الحمض النووي الأجنبي المرتبط بـ ori أيضًا في التكاثر.

2. موقع الاستنساخ

  • نقطة دخول أو تحليل للهندسة الوراثية.
  • يتم هضم ناقلات الحمض النووي في هذا الموقع ويتم إدخال الحمض النووي الأجنبي بمساعدة إنزيمات التقييد.
  • اكتشفت الأعمال الحديثة بلازميدات ذات مواقع استنساخ متعددة (MCS) والتي تؤوي ما يصل إلى 20 موقع تقييد.

3. محدد قابل للتحديد

  • الجين الذي يمنح مقاومة لمضادات حيوية معينة أو عامل انتقائي والذي ، في ظل الظروف العادية ، يكون قاتلاً للكائن الحي المضيف.
  • يمنح الخلية المضيفة خاصية البقاء على قيد الحياة والتكاثر في وسط مستنبت يحتوي على مضادات حيوية معينة.

4. علامة أو مراسل الجينات

  • يسمح بفحص الحيوانات المستنسخة الناجحة أو الخلايا المؤتلفة.
  • تستخدم على نطاق واسع في اختيار الأزرق والأبيض.

5. عدم القدرة على التحويل عن طريق الاقتران

  • يجب ألا تمكن النواقل الحمض النووي المؤتلف من الهروب إلى التجمعات الطبيعية للخلايا البكتيرية.

أنواع نواقل الاستنساخ

E. الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC)

كروموسوم الخميرة الاصطناعي (YAC)

كروموسوم الإنسان الاصطناعي (HAC)

أ. البلازميدات

  • كانت البلازميدات هي النواقل الأولى التي استخدمت في استنساخ الجينات.
  • إنها تحدث بشكل طبيعي وتنسخ بشكل مستقل جزيئات DNA دائرية مزدوجة الشريطة مزدوجة الكروموسومات. ومع ذلك ، ليست كل البلازميدات دائرية المنشأ.

  • توجد في البكتيريا والعتائق وحقيقيات النوى.
  • يتراوح حجم البلازميدات من 1.0 كيلو بايت إلى 250 كيلو بايت.
  • يمكن استنساخ إدخال DNA يصل إلى 10 كيلو بايت في البلازميدات.
  • تحتوي البلازميدات على عدد نسخ مرتفع وهو مفيد لإنتاج عائد أكبر من البلازميد المؤتلف للتجارب اللاحقة.
  • يتم استغلال البلازميدات ذات عدد النسخ المنخفض في ظل ظروف معينة مثل الجين المستنسخ ينتج البروتين السام للخلايا.
  • تقوم البلازميدات فقط بترميز تلك البروتينات الضرورية لتكاثرها. توجد جينات ترميز البروتين بالقرب من ori.

أمثلة: pBR322 ، pUC18 ، F البلازميد ، كول بلازميد.

تسمية ناقل استنساخ البلازميد: يحتوي متجه الاستنساخ pBR322 على العناصر التالية:


لماذا إنتاج بلازميد الإعدادية منخفضة للغاية؟ يتم تحديد عدد نسخ البلازميد لكل خلية بكتيرية من خلال أصل النسخ المتماثل على البلازميد. بعض الأصول لديها عدد نسخ منخفض متأصل. تحقق من رقم نسخة أصل النسخ المتماثل على البلازميد الخاص بك. بالنسبة للبلازميدات منخفضة النسخ ، قم بزيادة كمية ثقافة الإشريكية القولونية لإعداد DNA البلازميد من أجل الحصول على عائد دنا مرضي.

حجم الثقافة البكتيرية منخفض جدًا بالنسبة لعمود تحضير البلازميد

يرجى التحقق من سعة الربط لعمود تحضير البلازميد وما إذا كان البلازميد الخاص بك هو بلازميد عالي أو منخفض النسخ. بالنسبة للإعدادات الصغيرة ، نوصي بحصاد 1-5 مل من المزرعة البكتيرية بين عشية وضحاها. بالنسبة للإعدادات القصوى ، إذا كان البلازميد عبارة عن بلازميد عالي النسخ ، فإننا نوصي باستخدام 100-150 مل من المزرعة البكتيرية طوال الليل إذا كان البلازميد عبارة عن بلازميد منخفض النسخ ، نوصي باستخدام 300-500 مل من المزرعة البكتيرية طوال الليل. عادة ، بالنسبة للبلازميد عالي النسخ ،

يمكن استخراج 5 ميكروغرام من DNA البلازميد من كل 1 مل من المزرعة في الإعداد المصغر و

يمكن الحصول على 500 ميكروغرام من DNA البلازميد من 150 مل من مزرعة للبلازميد منخفض النسخ (مثل PET) ، ويمكن حصاد 1.5-2.5 ميكروغرام من DNA البلازميد من كل 1 مل من المزرعة في الإعداد المصغر و 150-200 ميكروغرام من DNA البلازميد يمكن الحصول عليها من 150 مل من الثقافة.

فقط جزء بسيط من البكتيريا في الثقافة السائلة يحتوي على البلازميدات

بعض المضادات الحيوية ، وخاصة الأمبيسلين ، تتحلل بسرعة في المزرعة السائلة. As a result, bacteria that do not contain plasmids can propagate to a significant fraction of the culture, causing poor yield of the plasmid prep. To avoid this, please prepare ampicillin containing growth medium freshly before use and make sure that enough ampicillin is supplied. Also, when culturing ampicillin-resistant bacteria, do not let the liquid culture saturate for too long before harvesting. Besides insufficient antibiotics in the culture, extracting plasmid DNA from very old culture can also result in low yield, since many bacterial cells are dead and plasmid DNA they contain is degraded. Therefore, try to extract plasmid DNA from fresh culture. If plasmid prep cannot be performed immediately, you can spin down the bacteria and store the pellet in -80 ° C freezer for later plasmid prep.

The liquid culture is directly inoculated from E. coli stab culture

Direct inoculation of a liquid culture from the E. coli liquid stock or stab culture you have received from VectorBuilder can very occasionally result in low yield. We recommend streaking the stock onto an LB agar plate containing the appropriate antibiotic first, and then inoculating a liquid culture with a fresh colony growing from that plate. Detailed user instructions can be found by going to menu item Learning Center & GT توثيق & GT Stab Culture.

You have not carefully followed the manual of the plasmid prep kit

If you use a plasmid prep kit, please carefully read the manual before use. Improper operations can often lead to poor performance of the kit.

The mini/maxi prep column is low-quality

Some brands of plasmid DNA prep columns perform poorly or inconsistently for DNA preparation.


أساليب

Bacterial strains, plasmids and materials

The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Additional file 2: Table S1. بكتريا قولونية DH5α was used in plasmids construction and amplification. B. sutilis 168 were used in the determinations of plasmids properties. B. الرقيقة WB600 was employed in gene expressions. The sequences of the alkaline pectate lyase from Paenibacillus ص. 0602 (pelN, GenBank: KC351190.1), the alkaline protease gene spro1 from alkaliphilic عصية ص. 221 (spro1, Sequence ID: D13157.1) and the pullulanase gene pulA11 من عند Anoxybacillus ص. LM18-11 (GeneBnak ID: HQ844266.1) were deposited in NCBI. The restriction endonucleases and DNA polymerase were commercially supplied by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. All other enzymes, chemicals and reagents were purchased from TaKaRa Biotechnology (Dalian, China) Co., Ltd.

Cultivation conditions

All cells were routinely grown at 37 °C and 200 rpm in Luria–Bertani (LB) medium or fermentation medium. LB medium (1 L) consisted of tryptone 10 g, yeast extract 5 g and NaCl 5 g. 1 L of fermentation medium consisted of tryptone 16 g, soluble starch 37 g, CaCl2 1.5 g, NaCl 2 g, MgSO4· 7 ح2O 0.2 g, KH2ص4 1 g, FeSO4· 7 ح2O 0.05 g and (NH4)2وبالتالي4 1.5 g. Different antibiotics (50 μg/mL kanamycin and 25 μg/mL kanamycin) were added in the medium for the relevant recombinant strains.

B. الرقيقة WB600 strains containing recombinant plasmids were cultured in Shake flask (SHUNIU, GG-17, Sichuan SHUBO Co., LTD, China) or in a 10-L fermenter (5BG, bxbio, China) to produce foreign proteins. The shake-flask culturing was performed as followed. A 5 mL aliquot of LB medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin was inoculated with a frozen glycerol stock of recombinant strain (20 μL), and then incubated for up to 14 h at 37 °C and 200 rpm in a rotary shaker (ZQWY-200G, Shanghai Zhichu Instruments Co., Ltd., China). An aliquot of this preculture (0.5 mL) was transferred into a 250 mL shake-flask that was loaded with 50 mL of LB medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin, which was then shaken in the rotary shaker (200 rpm) at 37 °C. After culturing for 48 h, samples of each culture were collected and analyzed for enzyme activities. The culture was harvested by centrifugation at 12,000×ز for 10 min at 4 °C to obtain the culture supernatant. Enzyme activities in the supernatant were determined with corresponding assays. Then the culture supernatant was analyzed with SDS-PAGE. The percentages of the produced extracellular proteins were calculated by a software Gel-Pro analyzer 4.0 (Media Cybernetics, CA, USA).

Fermentation of the recombinant B. الرقيقة WB600 strain was performed in a 10-L fementer. The seed culture was prepared as described in the above section and then used to inoculate an initial batch of fermentation medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin. The biomass and enzyme activities were analyzed at designated time intervals. The cell density was determined by measuring the OD600nm with a UV-1800/PC spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA). To determine the wet cell weight (WCW), a 2-mL sample of the culture broth were centrifuged at 12,000×ز for 10 min at 4 °C. The resulting pellet was collected and weighed. The enzyme activities in the culture supernatant were further determined with corresponding methods. The whole fermentation process was stopped and finished when continuous reductions of biomass and enzyme activities were observed.

Shuttle plasmids construction

Construction of shuttle plasmids is schematically presented in Fig. 1. All plasmids were constructed through the method of MEGAWHOP [51]. All of the specific primers used for PCR amplification were synthesized by the Beijing Genomics Institute (BGI) and listed in Table 1 and the isolation and manipulation of recombinant DNA were performed according to the previously published protocol [52]. 1.5 mL of culture was poured into a 2 mL EP tube and centrifuged at 12,000×ز for 10 min at 4 °C. The supernatant was discarded and the bacterial pellet was collected. The bacterial samples were treated with solution I (100 mL of solution I consisted of 1 M pH 8.0 Tris–HCl, 2.5 mL 0.5 M EDTA 2 mL ddH2O 91 mL 20% sterile glucose 4.5 mL), solution II (100 mL of solution II consisted of 10% SDS 50 mL 2 M NaOH 50 mL), solution III (500 mL of solution III consisted of KAc 147 g HAc 57.5 mL, ddH2O was added to 500 mL), mixture of phenol: chloroform (volume ration 1:1) and 70% ethanol successively according to the protocol. The DNA sample was dissolved with 80 μL ddH2O and stored in − 20 °C for further experiments.

According to the map obtained after sequencing, the 169 bp fragment of the membrane-binding region BA3 originating from pUB110 was deleted during construction of pWB980. In order to be mentioned conveniently, the remaining 346 bp fragment of BA3 was named BA3-1 in this work as shown in Fig. 1. pWB980 is consist of five parts: BA3-1, P43 promoter cohered with a signal-peptide sequence, the replicase-coding gene rep في B. subtilis, the kanamycin-resistance gene kanR and the bleomycin gene bleoR gene (Fig. 1). في هذا العمل ، فإن bleoR was deleted with primers DB-1/DB-2. The plasmid replication origin ori (888 bp) from pUC19 was inserted at the four sites up- and down-stream BA3-1 region and rep gene in pWB980-DB (3388 bp) separately. With primer pairs P1-S/P1-A and P2-S/P2-A, ori integrated into the site (659 bp) upstream the BA3-1 with forward and reverse directions. The recombinant plasmids were named as pUC980-1 and pUC980-2 respectively. At the site (169 bp) downstream the BA3-1, primers P3-S/P3-A and P4-S/P4-A were used in ori-insertions, resulting plasmids pUC980-3 and pUC980-4 in forward and reverse directions. Upstream the rep gene, the ori was inserted at the 3118 site using primers P5-S/P5-A and P6-S/P6-A. The recombinant plasmids were named as pUC980-5 and pUC980-6 with forward and reverse ori-insertions respectively. Ori was put into the 1722 site downstream the rep by using primers P7-S/P7-A and P8-S/P8-A. The plasmid with forward ori insertion was pUC980-7 and the other one was pUC980-8.

With primer pair 62-S/62-A, the alkaline pectate lyase gene pelN was inserted into the sites after the P43 promoter of plasmids pWB980, pWB980-DB and all pUC980-serial plasmids except pUC980-8. The recombinant plasmids were pWB980-pelN, pWB980-DB-pelN, pUC980-1-pelN, pUC980-2-pelN, pUC980-3-pelN, pUC980-4-pelN, pUC980-5-pelN, pUC980-6-pelN and pUC980-7-pelN correspondently.

Determination of plasmid copy number by quantitative real time PCR (qPCR)

The quantitative real-time PCR (qPCR) was performed using iQ™ SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad) as described by Turgeon [53]. ال dnaN و kanR genes were chosen as a single copy reference gene on the B. الرقيقة chromosome and the test gene in plasmids correspondingly [54,55,56]. Specific primer pairs dnaNS/dnaNA and kanS/kanA (Table 1) were designed to generate products of approximately 150 bp. The standard curves were prepared based on the pMD-18-T vector. The PCR mixtures (total volume 20 μL) contained 10 μL 2xTakara SYBR Green Real-Time PCR Master Mix, 1.5 μL forward and reverse primers (10 μM) and 1 μL diluted (10 −1 to 10 −4 ) sample DNA. The reaction condition was as followed: 95 °C for 10 min, 45 cycles of 95 °C for 10 s, 62 °C for 20 s, and 72 °C for 30 s, followed by a gradient temperature from 55 °C to 95 °C. The calculated mean of the kanR gene in each compared plasmid was divided by the dnaN gene (single-copy reference), resulting the copy number. All experiments were performed with three independent biological replicates.

Plasmid stability assay

Plasmid segregational stability in B. الرقيقة 168 was detected according to the method of Bron and Luxen [39] with minor modifications. Single colonies on kanamycin selective (25 μg/mL) LB agar plate were used to inoculate 5 mL kanamycin selective (25 μg/mL) LB medium. After 24 h culturing at 37 °C, the cultures were diluted 1:1000 in fresh LB media without antibiotics and incubated at 37 °C. This iterative subculturing process was repeated every 24 h for 30 consecutive days. Samples taken at appropriate intervals were checked for the fraction of plasmid-containing cells by replica plating on LB agar plates containing 25 μg/mL kanamycin.

N: Total amount of colonies on the selectable plate.

Plasmids were extracted from host cells after 30-days continuously culturing and detected the structural stability by EcoRI/HindIII enzyme-digestion verifications.

Alkaline pectate lyase assay

The pectate lyase activity was measured using the method described previously by Wang et al. [57]. 20 μL of the diluted enzyme solutions were added to 400 μL of 0.2% pectin in 50 mmol/L glycine–NaOH buffer (with 50 μmol/L CaCl2) at pH 9.0. The reaction mixture was incubated at 65 °C for 10 min, and the reaction was terminated by adding 580 μL of 30 mmol/L H3ص4. The product yields were detected using a spectrophotometer at 235 nm (Epoch 2, BioTek, USA). One standard enzyme unit was defined as the yield of 1 μmol unsaturated pectin per minute under the above-mentioned conditions.

Alkaline protease assay

The alkaline protease activity was measured using the modified method described by Tjalsma et al. [28]. One standard enzyme unit was defined as the as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μg casein minute under the situation of pH 9.0, 50 °C. 250 μL of the diluted enzyme solution were mixed with 250 μL solution containing 2% casein in pH 9.0 buffer. The mixture was incubated at 50 °C for 10 min, and the reaction was terminated by adding 500 μL 0.4 M TCA. The productions were detected using a spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA) at 280 nm. Casein with concentrations from 0 to 500 μg/mL were used as standard.

Pullulanase assay

Pullulanase activity was measured using the modified dinitrosalicylic acid (DNS) method [58]. One standard enzyme unit was defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol reducing sugar per minute under the assay conditions. Glucose with concentrations from 0 to 400 mg/mL were used as standard. 50 μL of the diluted enzyme solutions were added into the 450 μL reaction mixture containing 5% pullulan solutions and the pH 6.0 buffer at the volume ratio of 1:8. After incubations at pH 6.0, 60 °C for 30 min, 500 μL DNS were used to stop the reactions. The productions were detected using a spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA) at 540 nm. The amount of reducing sugar released during incubations were tested as the enzyme-index.

SDS-PAGE

B. الرقيقة WB600 transformant cells harboring recombinant plasmids were cultured in LB medium containing 25 μg/mL kanamycin at 37 °C for 48 h. The cultures (0.5 mL respectively) were centrifuged at 5000 rpm, 4 °C for 10 min and the supernatant solutions were reserved. The cell pellets were re-suspended in 0.5 mL ddH2O, followed by sonication to release intracellular content. Extracellular proteins were precipitated with 13% (w/v) TCA for 30 min on ice, then the precipitates which were collected by 10 min centrifugation at 4 °C and 13,000×ز, were carefully washed with ice-cold acetone and dried under vacuum. The collective proteins were dissolved in 20 μL urea (6 M) and mixed with appropriate volume of 4 × SDS loading buffer. Samples were then heated in boiling water bath for 10 min and centrifuged at 13,000×ز for 10 s. 12 μL of the samples were loaded onto 10% SDS-PAGE and run at 20 mA for around 1 h. Gel was stained using Coomassie brilliant blue dye.


شاهد الفيديو: الاستنساخ بالبلازميد (كانون الثاني 2022).