معلومة

منتج rtPCR التسلسلي


لذلك لدي مجموعة تم التحقق من صحتها من البادئات لـ rtPCR من Biorad التي تحتوي على SYBR الأخضر. إذا قمت بإجراء rtPCR ، فهل يمكنني استخدام منتج rtPCR بعد تنقيته باستخدام مجموعة تنقية Qiagen PCR؟ أيضًا ، لدي انطباع بأن شركة التسلسل تحتاج إلى مواد أولية للقيام بالتسلسل ، فهل أستخدم فقط جهاز PCR التمهيدي أو أحد البادئات "الشاملة" التي تمتلكها الشركة؟


يمكنك استخدام مجموعة تنقية PCR لتنظيف الحمض النووي.

يمكنك استخدام البادئات التي استخدمتها لـ RTPCR للتسلسل. لن تعمل البادئات العامة إلا إذا كان التسلسل المكمل لها موجودًا في نهاية 3 'من amplicon الخاص بك.


تسلسل منتج RT-PCR - (مارس / 14/2013)

لذلك لدي مجموعة تم التحقق من صحتها من البادئات لـ rtPCR من Biorad التي تحتوي على SYBR الأخضر. إذا قمت بإجراء rtPCR ، فهل يمكنني استخدام منتج rtPCR بعد تنقيته باستخدام مجموعة تنقية Qiagen PCR؟ أيضًا ، لدي انطباع بأن شركة التسلسل تحتاج إلى مواد أولية للقيام بالتسلسل ، هل أستخدم فقط جهاز PCR التمهيدي أو أحد البادئات "العالمية" التي تمتلكها الشركة؟

بواسطة rtPCR تقصد الوقت الحقيقي أو النسخ العكسي- PCR؟ إذا كان الأول ، لتجنب الارتباك ، فمن الأفضل استخدام PCR الكمي (qPCR).

بقدر ما أعرف أن البادئات لا تحتوي على sybr green ، فإن عامل sybr يشبه إلى حد كبير بروميد الإيثيديوم من حيث أنه يعتمد على الإقحام بين خيوط الحمض النووي بكثافة معينة لكل bp ، وعلى هذا النحو يتم إضافة sybr كجزء من PCR mastermix. ومع ذلك ، من الممكن الحصول على بادئات ذات علامات فلورية (fl) مثل بادئات اختبار Taqman.

من الناحية العملية ، لا ينبغي أن يهم ما إذا كانت البادئات قد تم تمييزها للاستخدام في التسلسل ، على الرغم من أنني لم أجربها مطلقًا. أستطيع أن أتخيل أن التمهيدي ذو العلامات Fl قد يحجب الإشارة من بعض المكالمات الأساسية الأولية إذا تم استخدامها على الرغم من ذلك.

للتسلسل ، نعم ، تتطلب الشركة مواد أولية ، فأنت بحاجة إلى إعداد أنبوب يحتوي على الحمض النووي المستهدف وأداة تمهيدي واحدة فقط - إذا كان لديك كلا البادئين في نفس الأنبوب ، فستحصل على إشارة مختلطة حيث يتم تسلسل المناطق الأمامية والخلفية في وقت واحد (فكر في كيفية تكرار الحمض النووي واتجاه الخيطين).

البادئات العامة مخصصة فقط لتسلسل البلازميدات (وحتى مع ذلك ، فقط لبعض البلازميدات) إذا لم يكن منتجك موجودًا في بلازميد ، فأنت بحاجة إلى توفير التمهيدي الصحيح.

bob1 في الجمعة 15 آذار (مارس) 04:11:59 2013 قال:

بواسطة rtPCR تقصد الوقت الحقيقي أو النسخ العكسي- PCR؟ إذا كان الأول ، لتجنب الارتباك ، فمن الأفضل استخدام PCR الكمي (qPCR).

بقدر ما أعرف أن البادئات لا تحتوي على sybr green ، فإن عامل sybr يشبه إلى حد كبير بروميد الإيثيديوم من حيث أنه يعتمد على الإقحام بين خيوط الحمض النووي بكثافة معينة لكل bp ، وعلى هذا النحو يتم إضافة sybr كجزء من PCR mastermix. ومع ذلك ، من الممكن الحصول على بادئات ذات علامات فلورية (fl) مثل بادئات اختبار Taqman.

من الناحية العملية ، لا ينبغي أن يهم ما إذا كانت البادئات قد تم تمييزها للاستخدام في التسلسل ، على الرغم من أنني لم أجربها مطلقًا. أستطيع أن أتخيل أن التمهيدي ذو العلامات Fl قد يحجب الإشارة من بعض المكالمات الأساسية الأولية إذا تم استخدامها على الرغم من ذلك.

للتسلسل ، نعم ، تحتاج الشركة إلى مواد أولية ، فأنت بحاجة إلى إعداد أنبوب يحتوي على الحمض النووي المستهدف وأساس واحد فقط - إذا كان لديك كلا البادئين في نفس الأنبوب ، فستحصل على إشارة مختلطة حيث يتم تسلسل المناطق الأمامية والخلفية في وقت واحد (فكر في كيفية تكرار الحمض النووي واتجاه الخيطين).

البادئات العامة مخصصة فقط لتسلسل البلازميدات (وحتى مع ذلك ، فقط لبعض البلازميدات) إذا لم يكن منتجك موجودًا في بلازميد ، فأنت بحاجة إلى توفير التمهيدي الصحيح.


شكرا لتوضيح هذا لي. نعم قصدته qPCR. ولا تحتوي البادئات الأولية على SYBR green ، وهو جزء من المزيج الرئيسي ، أنت على حق. ارتكبت بعض الأخطاء في وصف ما أريد القيام به لأن هذه هي المرة الأولى التي أحاول فيها PCR.

يجب أن تسأل الشركة عما إذا كان قالب SYBR يتداخل مع أجهزة التسلسل الخاصة بهم. الطريقة الأكثر أمانًا للقيام بذلك هي تنقية المنتج الذي رمى العمود (لقد استخدمت تلك من Thermo Fisher - مجموعة تنقية GenJet PCR) - معرف يفعل ما يقول


التسلسل المباشر لمنتجات PCR

للحصول على بيانات تسلسل عالية الجودة ، من المهم جدًا أن يكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل محددًا وقويًا. إذا كان منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن مسحة على هلام الاغاروز ، أو كان هناك أكثر من نطاق واحد ، فإن احتمالية الحصول على بيانات التسلسل الجيد منخفضة.

يجب عليك إزالة جميع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل والنيوكليوتيدات غير المدمجة قبل تسلسل المنتج. يستخدم التسلسل أساسًا واحدًا فقط بدلاً من الاثنين المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. إذا لم تقم بإزالة كلا البادئين ، فستحصل على تسلسلين متراكبين على بعضهما البعض لا يمكن قراءتهما.

لا بأس في استخدام جهاز PCR التمهيدي للتسلسل طالما أنه يطابق ظروفنا. لطفا أنظر إرشادات التمهيدي للمزيد من المعلومات.

تحقق مرتين من تركيز PCR باستخدام هلام الاغاروز التحليلي. التركيز المفرط على القالب الخاص بك لن يمنحك تسلسلًا أفضل ويمكن أن يتداخل مع عينات الباحثين المجاورة على الأداة.

يحتوي تطبيق Applied Biosystems على دليل مفيد لتسلسل PCR والذي يمكن تنزيله كملف PDF. ستحتاج إلى برنامج Acrobat Reader لإكمال التنزيل.

كتيب مفيد آخر هو دليل Qiagen لتنقية القالب وتسلسل الحمض النووي.

لا تمثل التوصيات الخاصة بالكتيبات الفنية الواردة أعلاه بأي حال من الأحوال تأييدًا لمنتجات ABI أو Qiagen.


تم تعيين التمهيدي الشامل لتضخيم وتسلسل مواقع انقسام HA0 لجميع فيروسات الأنفلونزا أ

يعد تحليل تسلسل موقع الانقسام الداخلي للبروتين داخل سلائف بروتين هيماجلوتينين (HA) HA (0) أساسيًا لدراسات البيولوجيا الجزيئية لفيروسات الإنفلونزا A ، على وجه الخصوص ، من أجل التنميط المرضي الجزيئي للنوع الفرعي H5 و H7 العزلات. تتمثل المشكلة الحالية للتشخيص الروتيني في ظهور سلالات جديدة من النوع الفرعي H5 أو H7 أو حتى الأنواع الفرعية الأخرى التي تفلت من الكشف عن طريق بروتوكولات النسخ العكسي PCR (RT-PCR) شائعة الاستخدام. هنا ، تم الإبلاغ عن أول مقايسة RT-PCR لعموم HA (PanHA) تستهدف موقع انقسام HA (0) لفيروسات الإنفلونزا A لجميع الأنواع الفرعية لـ HA البالغ عددها 16. تم تقييم الاختبار بالمقارنة مع RT-PCRs الخاصة بالنوع الفرعي H5 و H7 لموقع الانقسام HA (0) و RT-PCR في الوقت الحقيقي للكشف عن الجين M. تم استخدام لوحة من 92 من فيروسات الأنفلونزا أ للتحقق من صحة. تم إنشاء بيانات التسلسل لفيروسات الإنفلونزا A المأخوذة من 32 عينة من السائل السقائي و 11 عينة مسحة تشخيصية لجميع الأنواع الفرعية لـ HA البالغ عددها 16 عن طريق التسلسل المباشر لمنتجات PanHA RT-PCR. توضح النتائج أن اختبار PanHA RT-PCR الجديد - متبوعًا بتسلسل الدورة - يمكن أن يكمل الطرق الحالية ويعزز موثوقية تشخيصات فيروس الأنفلونزا A ، مما يسمح بكل من التنميط المرضي الجزيئي (H5 و H7) والتصنيف الفرعي (غير H5 أو - H7) ضمن نهج واحد.


نتائج ومناقشة

من خلال إستراتيجية RNomics الحسابية ، حدد الطلاب حوالي 80 snoRNAs مع ميزات هيكلية نموذجية لمربع C / D عائلة snoRNA من ن. كراسا, C. glabrata, D. hansenii, K. اللاكتيس، و Y. ليبوليتيكا. أظهر التحليل الحسابي أن هذه snoRNAs موجودة في شكل مجموعة واحدة أو جينية وتظهر منظمات جينومية متنوعة في فطريات مختلفة. معظم snoRNAs من C. glabrata و K. اللاكتيس يتم نسخ snoRNA بشكل مستقل ، بينما يتم نسخ snoRNAs من ن. كراسا D. hansenii، و Y. ليبوليتيكا كانت متداخلة داخل إنترونات جينات المضيف.

في المختبر ، عمل الطلاب بشكل فردي. اختار كل طالب واحدًا من snoRNA أو مجموعة snoRNA واحدة لإكمال تجربته. في البداية ، عزل الطلاب الحمض النووي الريبي الكلي من هذه الفطريات. باستخدام الطريقة المذكورة أعلاه ، حصل جميع الطلاب على 250-300 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من 10 مل من مزرعة الخلايا الفطرية. كانت نسب A260 / A280 لتحضيرات الحمض النووي الريبي 1.85-1.98 ، مما يدل على نوعية جيدة من الحمض النووي الريبي فيما يتعلق بالنقاء. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الرحلان الكهربائي للهلام الذي يعمل على تغيير طبيعة agarose فورمالدهايد ثلاثة نطاقات متميزة وكان نطاق 25S rRNA أكثر كثافة بشكل ملحوظ من نطاق 18S rRNA ، مما يشير إلى أن RNAs المستخرجة من الفطريات كانت سليمة تمامًا ولم يحدث تدهور RNA. يتم عرض نتائج اثنين من المواد الهلامية للطالب في الشكل 1.

تحليل الرحلان الكهربي لمجموع الحمض النووي الريبي من الفطريات. المسار 1 ، إجمالي الحمض النووي الريبي من ن. كراسا. المسار 2 ، إجمالي الحمض النووي الريبي من D. hansenii. تكون الرنا الريباسي لـ 25S و 16 S و 5.8S مرئية بشكل كبير على الهلام.

بعد ذلك ، أجرى الطلاب RT-PCR لتحليل تعبير snoRNA. حصل معظم الطلاب على منتجات RT-PCR. بالنسبة للطلاب الذين لم يتمكنوا من الحصول على منتجات RT-PCR ، كان لدى المدرسين طلاب نجحوا في مشاركة منتجاتهم حتى يتمكن جميع الطلاب من مواصلة التقدم خلال المشروع. يوضح الشكل 2 نتائج أحد الطلاب. قام الطالب بتحليل مجموعة جينات snoRNA الموجودة في سلالة مضادة من جين بروتيني مفترض في ن. كراسا الجينوم بواسطة RT-PCR. لأن الجين يحتوي على اثنين من introns (الشكل 2أ) وفقًا لبرنامج التحليل ، يجب أن تحتوي منتجات RT-PCR على ثلاثة نطاقات. كما هو متوقع ، منتجات RT-PCR من ن. كراسا يتكون إجمالي الحمض النووي الريبي ، مع زوج التمهيدي P1 / P2 ، من ثلاثة نطاقات ، أكبرها (511 نقطة أساس) تطابق تسلسل منتج PCR من ن. كراسا الحمض النووي الجينومي ، أصغر منتج RT-PCR (120 نقطة أساس) يتوافق مع نسخة مقسمة تفتقر إلى تسلسلين intronic ، وكان الوسط هو الوسيط الوسيط ، حيث تمت إزالة إنترون واحد (الشكل 2)ب). تحقق استنساخ وتسلسل منتجات RT-PCR الثلاثة من حدوث نسخ مقسمة ناضجة ووسائط لصق تمت إزالة الإنترونات منها في الموضع الدقيق كما هو متوقع (الشكل 3). أظهرت النتائج أعلاه أن التحليل الحسابي لمواقع الوصلة صحيح وأن الحمض النووي الريبي الذي أعده الطالب سليم تمامًا حيث يمكن الحصول على جميع المنتجات المعبر عنها ، بما في ذلك السلائف ووسائط لصق ونسخ الجينات الناضجة.

تسلسل المرافقة العنقودية للجينات snoRNA وتحليلات RT-PCR. (أ) snR55 و snR61 المرافقة من ن. كراسا. تكون مناطق الترميز الخاصة بـ snoRNAs مظللة ، وتكون exons للـ RNA غير المشفر بالأحرف الكبيرة intron بأحرف صغيرة يشار إلى مواقع لصق وتسلسل المانحين / المستقبلين (محاصر). تشير الأسهم إلى مواقع الاشعال المستخدمة لتحليل RT-PCR. (ب) تحليل RT-PCR. المسار 1 ، RT-PCR ، بعد النسخ العكسي لـ ن. كراسا تم إجراء إجمالي RNA مع التمهيدي P1 ، PCR باستخدام زوج التمهيدي P1 / P2. يتوافق منتج RT-PCR الصغير (120 نقطة أساس) مع النسخة المقسمة غير المقسمة من السلائف للنسخة (511 نقطة أساس) يمكن اكتشافها أيضًا. المسار 2 ، التحكم في الحمض النووي ، PCR من ن. كراسا الحمض النووي الجيني مع زوج التمهيدي P1 / P2 هو منتج PCR المتوقع 511 نقطة أساس. المسار 3 ، التحكم في PCR ، PCR من ن. كراسا مجموع الحمض النووي الريبي مع زوج التمهيدي P1 / P2.

يتوافق تسلسل منتج RT-PCR مع النص المقسم من مجموعة الجينات snoRNA. يتم الإشارة إلى موضع الإنترون الذي تمت إزالته برأس السهم. (أ) الكشف عن إزالة intron الأول من لصق وسيطة. (ب) الكشف عن إزالة الإنترونات الثانية من لصق وسيط.

باختصار ، يمثل هذا الإجراء المخبري طريقة فعالة ومتسقة لإعداد الطلاب المتقدمين للمشاركة في البحث. يقدم هذا الإجراء للطلاب مفهوم RNomics ، و RNA غير المشفر ، و RNA splicing ، وتطبيق قواعد البيانات البيولوجية وأدوات المعلوماتية الحيوية ، وممارسة التقنيات الجزيئية الأساسية. نعتقد أن الإجراء يجب أن يكون قابلاً للتطبيق لدراسة الحمض النووي الريبي غير المشفر الآخر دون تعديل كبير.


التسلسل المباشر لفيروس التهاب الكبد A ومنتجات norovirus RT-PCR من المحار الملوث بيئيًا باستخدام البادئات M13 الذيل

يُعرف فيروس نوروفيروس البشري (HuNoV) والتهاب الكبد A (HAV) كأسباب رئيسية للأمراض غير البكتيرية المنقولة عن طريق الأغذية في الولايات المتحدة. يعتبر تسلسل الحمض النووي بشكل عام معيارًا للتنميط الجيني الفيروسي الدقيق لدعم التحقيقات الوبائية. نظرًا للتنوع الجيني لفيروسات النوروفيروس (NoV) ، غالبًا ما تستخدم مجموعات التمهيدي المتدهورة في النسخ العكسي التقليدي (RT) PCR و RT-Quantitative PCR (RT-qPCR) للكشف عن هذه الفيروسات ويتم استنساخ شظايا cDNA بشكل عام قبل التسلسل. تؤدي طرق اكتشاف HAV الحساسة والمحددة لـ RT-qPCR في الوقت الفعلي إلى إنتاج شظايا صغيرة بأحجام 89-150 بت في الثانية ، والتي قد يكون من الصعب تسلسلها. من أجل التغلب على هذه العقبات ، تم ذيل الاشعال norovirus و HAV باستخدام الاشعال M13 الأمامي والخلفي. يزيد هذا التعديل من حجم المنتج المتسلسل ويسمح بالتسلسل المباشر للأمبليكون باستخدام بادئات M13 التكميلية. تم تحليل منتجات HuNoV و HAV cDNA من المحار الملوث بيئيا باستخدام هذه الطريقة. كشفت محاذاة العينات المتسلسلة عن هويات نيوكليوتيد ≥95٪. يؤدي التخلص من بادئات NoV و HAV مع تسلسل M13 إلى زيادة حجم منتج cDNA ، ويوفر بديلاً للاستنساخ ، ويسمح بالتسلسل السريع والدقيق والمباشر لمنتجات cDNA التي تنتجها فحوصات RT-qPCR التقليدية أو الحقيقية.


منتجات NEBNext & reg ARTIC لتسلسل SARS-CoV-2

خاصة مع الظهور المستمر لمتغيرات SARS-CoV-2 التي تؤثر على انتقال الفيروس والمقاييس الأخرى المهمة للصحة العامة ، هناك حاجة متزايدة لطرق موثوقة ودقيقة وسريعة لتسلسل SARS-CoV-2. تستند مجموعات NEBNext ARTIC إلى العمل الأصلي لشبكة ARTIC ، التي قامت بسرعة بتكييف بروتوكولاتها مع SARS-CoV-2 (Josh Quick 2020. nCoV-2019 بروتوكول التسلسل v2 (GunIt)).

طريقة ARTIC هي نهج تسلسل الجينوم الفيروسي الكامل القائم على amplicon متعدد الإرسال (الشكل 1) ، وخيارات مجموعة NEBNext ARTIC متوافقة مع أنظمة تسلسل Illumina و Oxford Nanopore Technologies. تولد المجموعتان المتوافقتان مع تسلسل Illumina إدراجات مكتبة لـ

400 نقطة أساس ، لتسلسل 2 × 75 أو 2 × 250 ، على التوالي (الشكل 2). تحتوي وحدة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 RT-PCR على الكواشف المطلوبة فقط لتخليق (كدنا) وتضخيم (كدنا) المستهدف من الحمض النووي الريبي الجيني SARS-CoV-2.

الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل NEBNext ARTIC

لمزيد من مهام سير العمل التفصيلية ، استخدم الارتباطات أدناه:

الشكل 2: خيارات مجموعة أدوات NEBNext ARTIC



تتضمن مجموعات NEBNext ARTIC مجموعات V3 ARTIC التمهيدي ، والتي تم موازنتها باستخدام منهجية تم تطويرها في NEB بناءً على البيانات التجريبية من التسلسل. توفر هذه البادئات المتوازنة قدرًا أكبر من التوحيد في تغطية الجينوم (الشكل 3) من 10 إلى 10000 نسخة جينوم SARS-CoV-2. تم تحسين الكواشف الخاصة بـ RT-PCR وإعداد المكتبة لسير عمل SARS-CoV-2 ARTIC.

الشكل 3: قراءات أقل مطلوبة لتغطية الجينوم بالكامل باستخدام مجموعة رفيق NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies)

تصور عارض الجينوم التكاملي لتغطية القراءة عبر جينوم SARS-CoV-2. تم إنشاء الأمبليكونات من 1000 نسخة من مدخلات جرنا الفيروسي لـ SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 و VR-1991) في 100 نانوغرام من RNA المرجعي البشري العالمي (ThermoFisher QS0639) باستخدام لوحة IDT ARTIC nCoV-2019 V3 (& ldquoStandard & rdquo) أو مسابح NEBNext المتوازنة ARTIC SARS-CoV-2 التمهيدي. تم إنشاء المكتبات باستخدام NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Companion Kit (Oxford Nanopore Technologies) ومجموعات توسيع الترميز الأصلي لتكنولوجيا أكسفورد نانوبور 1-12 (EXP-NBD104) و 13-24 (EXP-NBD114) ، مجموعة تسلسل الربط ( SQK-LSK109) ومجموعة توسيع SFB (EXP-SFB001). كان التسلسل على أداة الشبكة باستخدام خلايا تدفق R9.4.1. تم استخدام Minimap2 مع 24500 قراءة أو بيانات 250x لرسم الخرائط ضد SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1.

الشكل 4: تغطية الجينوم على نطاق واسع من كميات الإدخال ، مع مجموعة إعداد مكتبة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina)

تم إنتاج الأمبليكونات من 1000 نسخة من مدخلات جرنا الفيروسي SARS-CoV-2 (ATCC VR-1986 و VR-1991) في 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المرجعي العالمي (ThermoFisher QS0639) باستخدام مسابح ARTIC SARS-CoV-2 المتوازنة من NEBNext ، مع أو بدون أزواج NEBNext ARTIC Human Control التمهيدي. تم إنشاء المكتبات باستخدام مجموعة إعداد مكتبة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS (Illumina) وتسلسلها على أداة MiSeq (2x75 نقطة أساس). تم تحديد جزء الجينوم المغطى عند كل عمق لمجموعة من المدخلات وقراءت العينة إلى 10.000 و 100.000 و 500.000 و 1.000.000.

شروط تفاعل RT هي نفسها بالنسبة لجميع كميات المدخلات ، وبالنسبة لتطبيقات Illumina ، فإن تركيبة بوليميريز DNA الجديدة لإثراء مكتبات تسلسل الجيل التالي تلغي الحاجة إلى تطبيع تركيزات amplicon قبل إعداد المكتبة.

  • تحسين التوحيد لعمق تغطية جينوم SARS-CoV-2
  • بروتوكولات مبسطة وعالية الكفاءة
  • فعال مع مجموعة واسعة من مدخلات الجينوم الفيروسي (10-10.000 نسخة)
  • متاح لمنصات تسلسل Illumina و Oxford Nanopore Technologies
  • شروط RT الفردية لجميع كميات المدخلات
  • لا توجد متطلبات لتطبيع amplicon قبل إعداد المكتبة (مجموعات متوافقة مع Illumina)
  • اختياري استخدام تحكم الإنسان التمهيدي المقدمة
  • يشمل عينات التنقية NEBNext (SPRIselect & reg)
  • محولات المكتبة والبرايمر متوفرة بشكل منفصل

اقرأ ما يقوله القادة في تسلسل ARTIC SARS-CoV-2

ستوفر مجموعة أدوات رفيق NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 (Oxford Nanopore Technologies) للباحثين الطريقة الأكثر ملاءمة لإجراء تسلسل nanopore لـ SARS-CoV-2. عند تطوير بروتوكول ARTIC ، ركزنا على استعادة الجينوم شبه الكامل من العينات السريرية الصعبة باستخدام & ltCt33. لقد اعتمدنا نهج amplicon 400 نقطة أساس لأنه يوفر أداءً قويًا عبر مجموعة واسعة من المدخلات بما في ذلك عينات Ct العالية والحمض النووي الريبي المتدهور والتي غالبًا ما يتم مواجهتها. يوفر سير عمل الترميز الأصلي أمبليكون كاملة الطول متوافقة مع أفضل الممارسات لإزالة تعدد الإرسال وبناء إجماع قائم على المراجع بينما يقلل إعداد المكتبة الخالية من تفاعل البوليميراز المتسلسل من مخاطر تلوث الأمبليكون. لقد عملنا بالتعاون مع NEB في تحسين البروتوكول لتقليل أحجام الكاشف مع تحسين الأداء وهذا الآن يستفيد أيضًا من مجموعات التمهيدي المحسّنة التي تعمل على تحسين اكتمال الجينوم بشكل كبير وتقليل متطلبات تغطية القراءة. يتيح التوافق مع مجموعة توسيع الرمز الشريطي الأصلية المكونة من 96 شريطًا المرونة لتشغيل ما بين 24 و 96 عينة حسب متطلباتك.

- جوشوا كويك ، دكتوراه ، جامعة برمنجهام وشبكة ARTIC

لقد تأثرنا بالأداء الرائع لمجموعة NEBNext ARTIC FS في تسلسل العينات البشرية التي تحتوي على SARS-CoV-2 RNA. مع هذه المجموعة ، نجحنا في معالجة عينات ذات جودة وكمية متفاوتة وقد أذهلنا حساسيتها وتوحيدها الملحوظ لتغطية الجينوم الفيروسي. لقد كان وقت الاستجابة السريع لسير العمل القوي مفيدًا حقًا لنا.

- فلاديمير بينيس ، رئيس المرفق الأساسي لعلم الجينوم في مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي

تضمن مجموعة أدوات إعداد مكتبة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS تحديدًا سريعًا ودقيقًا وموثوقًا للجينوم الكامل لـ SARS-CoV-2. نظرًا لسهولة الاستخدام ، تتيح مجموعة أدوات إعداد مكتبة NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS التكامل السريع في سير عمل NGS الروتيني. علاوة على ذلك ، لا تزال المجموعة تعمل بقوة مع العينات السريرية الصعبة (ct & gt30). أوصي بـ NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit 100٪.


تتلف قوالب الحمض النووي المزدوجة المجدولة عند درجة حرارة يتم تحديدها جزئيًا بواسطة محتوى G + C. كلما زادت نسبة G + C ، زادت درجة الحرارة المطلوبة لفصل خيوط قالب DNA. كلما طالت جزيئات الحمض النووي ، زاد الوقت المطلوب عند درجة حرارة التمسخ المختارة لفصل السلاسل تمامًا. إذا كانت درجة حرارة التمسخ منخفضة جدًا أو إذا كان الوقت قصيرًا جدًا في المناطق الغنية بـ AT ، فسيتم تغيير طبيعة الحمض النووي. عندما تنخفض درجة الحرارة لاحقًا في دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، سيعيد الحمض النووي للقالب إلى الحالة الأصلية تمامًا. في تفاعل البوليميراز المتسلسل المحفز بواسطة بوليميريز Taq ، يتم التمسخ عند 94-95 درجة مئوية ، وهي أعلى درجة حرارة يمكن أن يتحملها الإنزيم لمدة 30 دورة أو أكثر دون التعرض لأضرار مفرطة. في الدورة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، يتم أحيانًا إجراء التمسخ لمدة 5 دقائق لزيادة احتمالية تشويه الجزيئات الطويلة من الحمض النووي بشكل كامل. ومع ذلك ، فإن هذه الفترة الممتدة من درجة حرارة التمسخ غير ضرورية لجزيئات الحمض النووي الخطية لأنها قد تكون ضارة في بعض الأحيان. يتم استخدام التمسخ لمدة 45 ثانية عند 94-95 درجة مئوية بشكل روتيني لتضخيم جزيئات الحمض النووي الخطية التي يبلغ محتواها GC & lt55٪ ودرجة حرارة أعلى للقالب و / أو الحمض النووي المستهدف الذي يكون محتواه من GC هو 55٪. ويفضل في مثل هذه الحالات المزيد من البوليميرات المقاومة للحرارة.

درجة الحرارة المستخدمة لخطوة التلدين أمر بالغ الأهمية. إذا كانت درجة حرارة التلدين عالية جدًا ، فإن البادئات قليلة النوكليوتيد تصلب بشكل سيئ ، إذا كانت على الإطلاق في القالب ويكون إنتاج الحمض النووي المتضخم منخفضًا جدًا. إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا ، فقد يحدث تلدين غير محدد للبادئات ، مما يؤدي إلى تضخيم الأجزاء غير المرغوب فيها من الحمض النووي. يتم إجراء التلدين عادة بمقدار 3-5 درجات مئوية أقل من درجة حرارة الانصهار المحسوبة التي تنفصل فيها البادئات قليلة النوكليوتيد عن قوالبها. توجد العديد من الصيغ لتحديد Tm النظري ، ولكن لا يوجد أي منها دقيق بالنسبة لبادئات قليل النوكليوتيد لجميع الأطوال والتسلسلات. من الأفضل تحسين ظروف التلدين عن طريق إجراء سلسلة من تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل عند درجات حرارة تتراوح من 2 درجة مئوية إلى 10 درجات مئوية أقل من درجات حرارة الانصهار المنخفضة المحسوبة لبادئي قليل النوكليوتيد. بدلاً من ذلك ، يمكن برمجة جهاز التدوير الحراري لاستخدام درجات حرارة تلدين منخفضة تدريجيًا في أزواج متتالية من الدورات ("اللمس" PCR. بدلاً من مسح مجموعة متنوعة من ظروف التلدين في PCRs منفصلة ، يتم تحقيق التحسين عن طريق تعريض PCR واحد إلى سلسلة متسلسلة من التلدين بدرجات متتالية من التفاعل.

تمديد بادئات قليل النوكليوتيد يتم إجراؤه عند أو بالقرب من درجة الحرارة المثلى لتخليق الحمض النووي المحفز بواسطة البوليميراز القابل للحرارة ، والذي يكون في حالة بوليميريز Taq 72-78 درجة مئوية. موقع التمهيدي الآخر. في الدورة التالية ، يتم إنتاج الجزيئات الأولى التي يكون طولها مساويًا لجزء من الحمض النووي المحدد بواسطة مواقع الارتباط الخاصة بالبادئات. من الدورة الثالثة فصاعدًا ، يتم تضخيم هذا الجزء من الحمض النووي هندسيًا ، بينما تتراكم منتجات التضخيم الأطول حسابًا. معدل البلمرة لـ Taq polymerase هو

2000 نيوكليوتيدات / دقيقة عند درجة الحرارة المثلى (72-78 درجة مئوية) وكقاعدة عامة ، يتم التمديد لمدة دقيقة واحدة لكل 1000 نقطة أساس من المنتج. بالنسبة للدورة الأخيرة من PCR ، يستخدم العديد من الباحثين فترة تمديد أطول بثلاث مرات من الدورات السابقة ، ظاهريًا للسماح بإكمال جميع المنتجات المضخمة.


مقدمة

نظرة عامة على استراتيجيات التسلسل عالي الإنتاجية

تم استخدام الإستراتيجية القائمة على البندقية - أسلوب التفضيل لتسلسل جينومات الحمض النووي الكبيرة - لتوصيف الجينوم الكامل لمجموعة من حقيقيات النوى وبدائيات النوى 1،2،3،4،5،6. يتم تقطيع الحمض النووي الجيني إلى 2-50 كيلو بايت في شظايا 2 ، 3 و 5 نهايات يتم إصلاحها واستنساخها في ناقل بكتيري لإنتاج مكتبة. يتم تسلسل المناطق الطرفية البالغة 700 نقطة أساس لهذه الحيوانات المستنسخة باستخدام بادئات متجهية مستقلة عن الإدخال 7 ، ويتم إعادة بناء التسلسل الكامل من الأجزاء المتداخلة. حفزت مشاريع التسلسل واسعة النطاق على التحسينات التقنية الأخيرة لتقليل التكلفة والوقت اللازمين للحصول على حل أحادي التسلسل. تتكون هذه التطورات بشكل أساسي من بدائل لإنشاء مكتبات بكتيرية ولتسلسل الكيمياء الحيوية Sanger 8. ومن ثم ، تم مؤخرًا تطوير إجراءات التسلسل المتكاملة التي تشمل إنتاج المكتبات ، وتضخيم الحمض النووي ، والتسلسل والتجميع المتصل. لا تزال هذه التقنيات تعتمد على القص العشوائي للحمض النووي ولكنها تتيح فصل جزيئات القالب الفردية على الخرز وتضخيمها المستقل في نظام خالٍ من الخلايا بواسطة مستحلب PCR 11. يتم إجراء التسلسل بعد ذلك على كل حبة ، باستخدام التسلسل الحراري 12 أو التسلسل عن طريق الربط 10 بدلاً من طريقة سانجر التقليدية.

ومع ذلك ، فإن استخدام خطوط أنابيب التسلسل المتكاملة هذه يبدو غير مناسب عند تطبيقها على جينوم فيروسات الحمض النووي الريبي. أولاً ، الفيروسات طفيليات صغيرة داخل الخلايا يجب فصل كميات كبيرة من المادة الوراثية المستهدفة عن الأحماض النووية المضيفة لبناء المكتبة. وهذا يتطلب خطوات أولية لزراعة الأنسجة وتنبيذ فائق قبل القص والاستنساخ 13. بالإضافة إلى ذلك ، يصعب الحصول على الغلة المطلوبة من الأحماض النووية عند العمل على فيروسات الحمض النووي الريبي و / أو الفيروسات منخفضة التكاثر. مثل هذه الاستراتيجية تستغرق وقتًا طويلاً ، وصعبة في حالة العينات السريرية وخطيرة مع مسببات الأمراض البشرية. ثانيًا ، عادةً ما تكون جينومات الحمض النووي الريبي الفيروسي صغيرة و / أو مجزأة (1-10 كيلو بايت جزيئات). ثالثًا ، غالبًا ما تتكون جينومات فيروسات الحمض النووي الريبي من عناصر قصيرة محفوظة تتخللها مناطق طويلة تُظهر مستويات عالية من عدم التجانس الجيني. لذلك ، تتكون استراتيجية التسلسل الشائعة من تضخيم وتسلسل منتجات PCR الطويلة التي تم الحصول عليها باستخدام بادئات تستهدف المناطق الأكثر حفظًا. لهذه الأسباب ، اعتمدت الجينوميات القياسية للحمض النووي الريبي الفيروسي على تضخيم RT-PCR بمقدار 1-5 كيلو بايت في الثانية متبوعًا بالمشي التمهيدي ، والذي يتضمن من جديد توليف بادئات محددة لتمديد التسلسل إلى مناطق غير محددة. يتطلب توصيف تسلسل 4 كيلو بايت بهذه الطريقة ست جولات من التسلسل على الأقل. يجعل تصميم وتوليف مواد أولية جديدة هذه الاستراتيجية باهظة الثمن وتستغرق وقتًا طويلاً.

يمكن تقسيم الإجراءات البديلة إلى ثلاث مجموعات. الأول يتكون من استبدال الكيمياء الحيوية لتسلسل سانجر بتقنيات أرخص وأسرع ، مثل التسلسل الحراري أو التسلسل عن طريق الربط والتهجين. ومع ذلك ، فإن طول قراءتها القصير ، والمقتصر على 100 نقطة أساس ، يتكيف بشكل سيء مع التسلسل عالي الإنتاجية للجينومات القصيرة. يتجنب البديل الثاني من جديد التوليف التمهيدي عن طريق الاستفادة من مكتبة قليلة النوكليوتيد معدة مسبقًا. يمكن أن تكون المواد الأولية: (1) 5-10 أليغنوكليوتيدات مُصنَّعة عشوائيًا والتي تُستخدم إما بمفردها 14 ، 15 ، 16 أو في توليفة معيارية 17 ، 18 ، 19 ، 20 ، 21 ، 22 أو (2) أليغنوكليوتيدات ناتجة عن تخليق عالي الإنتاجية 23،24. حتى الآن ، يحد حجم مكتبات قليل النوكليوتيد المطلوبة من استخدام هذه الطرق. تم اقتراح طريقة مفهرس المشي 25 مؤخرًا: يتم تقديم الحمض النووي لدورات الهضم متبوعة بالربط النهائي لمحولات قليل النوكليوتيد ("الفهرس"). يتم تسلسل أحد طرفي الحمض النووي المستنسخ باستخدام التمهيدي العالمي M13 ، ويتم تحليل هذا التسلسل الأول للعثور على مواقع تقييد نوكلياز محددة قريبة من نهايته 3. يتم هضم الحمض النووي باستخدام الإنزيم المحدد قبل ربط مفهرس محدد مزدوج الشريطة ، يتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتقديمه إلى تسلسل Sanger المُجهز باستخدام المفهرس. تتكرر هذه الخطوات وتسمح بالتقدم أحادي الاتجاه في التسلسل غير المعروف. نظرًا لأن مكتبة المفهرس أصغر بكثير من تلك التي تم اقتراحها سابقًا ، فقد يكون المشي المفهرس طريقة جذابة من حيث التكلفة لأنها تتجنب التوليف المنهجي التمهيدي. ومع ذلك ، يظل الإجراء مضيعة للوقت للأسباب التالية: (1) اختيار المفهرس هو دالة لتسلسل النيوكليوتيدات المحدد في الدورة السابقة و (2) المعالجة التجريبية لدورة واحدة من الهضم - الربط ينطوي على تضخيم الحمض النووي و تنقية الحمض النووي عن طريق تنقية الهلام وترسيب الإيثانول والخرز المطلي بالستربتافيدين.

نظرة عامة على تقنية LoPPS

يستخدم البديل الثالث استراتيجية البندقية لإنشاء مكتبة DNA من شظايا قصيرة بما يكفي للسماح بالتسلسل الكامل من خطوة واحدة ، من منتج PCR. تتمثل إحدى الميزات الرئيسية لاستراتيجية البندقية في إمكانية أتمتة العملية بأكملها. تتيح أتمتة النمو البكتيري وتنقية الحمض النووي للبلازميد وتسلسله التسلسل السريع للعديد من جينومات الحمض النووي الكبيرة وفقًا لمعايير عالية الجودة مع ملفات تعريف جذابة للتكلفة. لقد طورنا إجراء تسلسل منتج PCR الطويل (LoPPS) (انظر الشكل 1) على أساس إستراتيجية البندقية هذه. يتم تقطيع ثلاثة إلى خمسة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، التي يتم إنشاؤها بواسطة أي طريقة PCR أو RT-PCR قياسية ، بشكل عشوائي بواسطة الموجات فوق الصوتية إلى شظايا DNA 700 زوج قاعدي. يتم إصلاح الطرف البارز لإنشاء نهايات حادة وإضافة 3 A-overhangs للسماح باستنساخ TA ولتجنب تسلسل الأجزاء. يتم توقع عدد الحيوانات المستنسخة المطلوبة لإعادة بناء contig من طول منتج PCR الأولي (انظر الجدول 1 والمرجع. 36). يتم اختيار الحيوانات المستنسخة عشوائيًا وتسلسلها باستخدام التمهيدي المتجه T7 PROM. أخيرًا ، يتم إعادة بناء التسلسل المستهدف من الأجزاء المتداخلة.


دعم المعلومات

S1 التين. المعالجة المسبقة لبيانات SCAN-seq ومراقبة الجودة.

(أ) رسم تخطيطي للمعالجة المسبقة لبيانات SCAN-seq (للحصول على التفاصيل ، انظر الطرق). (ب) توزيع طول منتجات (كدنا) قبل بناء المكتبة. (C ، D) توزيع الطول لقراءات كاملة الطول. يتم سرد البيانات الرقمية في بيانات S2. SCAN-seq ، تضخيم خلية واحدة وتسلسل الحمض النووي الريبي كامل الطول بواسطة منصة Nanopore.

S2 التين. جودة بيانات mESCs باستخدام SCAN-seq.

(أ) منحنى التشبع للجينات المكتشفة والأشكال الإسوية في مسك. (ب) خريطة الحرارة لقيمة الارتباط (بيرسون) بين كل زوج من mESCs. كانت قيمة الارتباط لـ mESCs بواسطة SCAN-seq أفضل حتى من تلك الموجودة في طريقة SUPeR-seq و Tang 2009. (ج) تغطية القراءات على طول النصوص الكاملة. (أ - ج) يتم سرد البيانات العددية في بيانات S2. mESC ، الخلايا الجذعية الجنينية للماوس SCAN-seq ، تضخيم الخلية الواحدة وتسلسل الحمض النووي الريبي كامل الطول بواسطة منصة Nanopore SUPeR-seq ، تسلسل الحمض النووي الريبي المستقل متعدد الخلايا (A) العالمي.

شكل S3. منحنى تشبع الجينات والأشكال الإسوية المكتشفة في الخلايا في مراحل نمو مختلفة.

يتم سرد البيانات الرقمية في بيانات S2.

S4 التين. تحليل التعبير الجيني في عينات جنينية الفأر.

(أ) عدد الجينات المكتشفة في كل خلية فردية في كل مرحلة / نوع تطوري. يتم سرد البيانات الرقمية في بيانات S2. (ب) مراسلات الجينات الخاصة بالمرحلة التي تم اكتشافها باستخدام SCAN-seq و SUPeR-seq. (ج) تحليل GO لمجموعة الجينات 6 في الشكل ثلاثي الأبعاد. GO ، علم الوجود الجيني SCAN-seq ، تضخيم الخلية المفردة وتسلسل الحمض النووي الريبي كامل الطول بواسطة منصة Nanopore SUPeR-seq ، تسلسل الحمض النووي الريبي المستقل متعدد الخلية (A) العالمي.

S5 التين. تم الكشف عن LncRNAs في أجنة الفئران قبل الغرس.

(أ) نسبة القراءة من mESCs وجميع blastomeres في مراحل نمو مختلفة. يمثل المركز المتوسط ​​، وتمثل أشرطة الخطأ SEM. (ب) خريطة الحرارة تظهر مستويات التعبير عن LncRNAs في جميع الخلايا. (أ ، ب) يتم سرد البيانات الرقمية في بيانات S2. lncRNA ، mESC طويل من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، الخلية الجذعية الجنينية للفأر SEM ، الخطأ المعياري للمتوسط.


شاهد الفيديو: BioRad CFX96 Touch Real Time PCR (كانون الثاني 2022).