معلومة

8.2: تقنيات التجزئة واللوني - علم الأحياء


تجزئة العينات ، كما يوحي الاسم ، هي عملية فصل مكونات أو أجزاء من المحللة. باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن إزالة حطام الخلية ، وترك مادة طافية تحتوي على محتويات الخلية. من خلال استخدام سرعات طرد مركزي أعلى على التوالي (وقوى g الناتجة) ، من الممكن فصل المكونات الخلوية المختلفة ، مثل النوى والميتوكوندريا ، وما إلى ذلك ، عن السيتوبلازم. يمكن بعد ذلك تفكيك هذه الجزيئات بشكل منفصل لتحرير الجزيئات الخاصة بالحيز الخلوي المعين. يمكن بعد ذلك فصل الجزء القابل للذوبان من أي محلول إلى مكوناته باستخدام طرق مختلفة.

العامود اللوني

إحدى الطرق القوية المستخدمة لهذا الغرض هي اللوني. سننظر في عدة مناهج كروماتوغرافية. يستخدم الفصل الكروماتوغرافي لفصل مكونات الخليط بناءً على الاختلافات في الحجم أو الشحن أو الخصائص الأخرى. أثناء الفصل الكروماتوغرافي ، يتحرك الطور المتحرك (المخزن المؤقت أو المذيب الآخر) عبر الطور الثابت (عادةً مصفوفة صلبة) حاملة مكونات الخليط. يتم فصل المكونات ، لأن المكونات المختلفة تتحرك بمعدلات مختلفة ، لأسباب تختلف حسب نوع الكروماتوغرافيا المستخدمة. سننظر في عدة أنواع مختلفة من اللوني لتوضيح هذه العملية.

  • كروماتوغرافيا التبادل الأيوني
  • كروماتوغرافيا الاستبعاد الهلامي
  • اللوني تقارب
  • HPLC

يتم إجراء هذه الاختلافات في الفصل الكروماتوغرافي مع المرحلة الثابتة المثبتة ضمن ما يسمى بالأعمدة (الشكل ( PageIndex {1} )). هذه هي الأنابيب التي تحتوي على المرحلة الثابتة (وتسمى أيضًا "الدعم" أو المرحلة الصلبة).

تتكون الدعامات من حبات صغيرة معلقة في المخزن المؤقت (الشكل ( PageIndex {3} )) وهي مصممة لاستغلال الكيمياء أو الاختلافات في الحجم لمكونات العينات وبالتالي توفير وسيلة للفصل. يتم "تعبئة" الأعمدة أو تعبئتها بالدعم ، ويحمل المخزن المؤقت أو المذيب خليط المركبات المراد فصلها من خلال الدعامة. تتفاعل الجزيئات في العينة بشكل تفاضلي مع الدعم ، وبالتالي تنتقل خلاله بسرعات مختلفة ، مما يتيح الفصل.

كروماتوغرافيا التبادل الأيوني

في كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، يتكون الدعم من حبيبات صغيرة متصلة بمواد كيميائية لها شحنة. قبل الاستخدام ، تتم موازنة الخرزات في محلول يحتوي على أيون مضاد مناسب للجزيء المشحون على الحبة. يوضح الشكل ( PageIndex {5} ) الوحدة المتكررة لبوليستيرول سلفونات ، وهو مركب يستخدم كراتنج التبادل الكاتيوني. كما ترون ، هذا الجزيء مشحون سالبًا ، وبالتالي ستتم معايرة الحبيبات في مخزن مؤقت يحتوي على أيون موجب الشحنة ، على سبيل المثال الصوديوم. في المعلق ، بوليستيرول سلفونات السالب الشحنة غير قادر على مغادرة الخرزات ، بسبب ارتباطه التساهمي ، ولكن يمكن "تبادل" الأيونات المضادة (الصوديوم) لجزيئات من نفس الشحنة.

التبادلات

وبالتالي ، سيكون لعمود التبادل الكاتيوني أيونات مضادة موجبة الشحنة وجزيئات سالبة الشحنة مرتبطة تساهميًا بالخرز. المركبات ذات الشحنة الموجبة من محلول الخلية التي تمر عبر العمود سوف تتبادل مع الأيونات المضادة و "تلتصق" بالمركبات سالبة الشحنة المرتبطة تساهميًا بالخرز. سوف تمر الجزيئات في العينة المحايدة المسؤولة أو السالبة الشحنة بسرعة عبر العمود. في هذه المرحلة ، سيتم ربط الجزيئات الموجبة الشحنة فقط من العينة الأصلية بالعمود. يمكن بعد ذلك غسلها ، أو التصفية التالفة ، باستخدام محاليل منظمة تحتوي على تركيزات عالية من الملح. في ظل هذه الظروف ، سيتعطل التفاعل بين الجزيئات المشحونة إيجابياً و polystyrosulfonate ، مما يسمح باستعادة الجزيئات المرتبطة بالعمود.

تبادل الأنيون

من ناحية أخرى ، في كروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، فإن المواد الكيميائية المرتبطة بالخرز تكون موجبة الشحنة وتكون العدادات سالبة الشحنة (كلوريد ، على سبيل المثال). الجزيئات سالبة الشحنة في محلول الخلية سوف "تلتصق" وستمر الجزيئات الأخرى بسرعة. لإزالة الجزيئات "العالقة" في عمود ما ، يحتاج المرء ببساطة إلى إضافة تركيز عالٍ من الأيونات المضادة لتحريرها.

الاستخدامات

تعتبر راتنجات التبادل الأيوني مفيدة لفصل الجزيئات الحيوية المشحونة عن الجزيئات غير المشحونة أو المشحونة عكسياً في المحلول. للراتنجات مجموعة متنوعة من التطبيقات الأخرى ، بما في ذلك تنقية المياه وتليينها. يوضح الشكل ( PageIndex {5} ) استخدام بوليمر بوليستيرول سلفونات في إزالة الكالسيوم لتليين الماء.


الشكل ( PageIndex {5} ): إزالة أيونات الكالسيوم بواسطة مبادل أيوني. ويكيبيديا

استبعاد حجم اللوني

كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (وتسمى أيضًا كروماتوغرافيا الاستبعاد الجزيئي ، أو كروماتوغرافيا الاستبعاد الهلامي ، أو كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي) هي طريقة فصل منخفضة الدقة تستخدم حبات ذات "أنفاق" صغيرة بداخلها يكون لكل منها فتحة دقيقة. يُشار إلى حجم الفتحة باسم "حد الاستبعاد" ، مما يعني أن الجزيئات فوق وزن جزيئي معين لن تكون قادرة على المرور عبر الأنفاق. الجزيئات ذات الأحجام الفيزيائية الأكبر من حد الاستبعاد لا تدخل الأنفاق وتمر عبر العمود بسرعة نسبيًا ، في الفراغات خارج الخرزات. تقوم الجزيئات الأصغر ، التي يمكنها دخول الأنفاق ، بذلك ، وبالتالي ، يكون لها مسار أطول تسلكه في المرور عبر العمود وتزيل الأخير (الشكل ( PageIndex {6} )).

يُظهر الشكل ( PageIndex {7} ) ملفًا شخصيًا لمجموعة من البروتينات مفصولة كروماتوجرافيا لاستبعاد الحجم باستخدام خرز مع حد استبعاد يبلغ حوالي 30.000 دالتون. البروتينات 30000 بوزن جزيئي أو مزال أكبر في حجم الفراغ (يسار) بينما يتم التخلص من البروتينات الأصغر لاحقًا (في الوسط واليمين).

اللوني تقارب

كروماتوغرافيا التقارب هي تقنية قوية للغاية وانتقائية تستغل الروابط الملزمة لجزيئات العينة (البروتينات عادةً) للجزيئات المرتبطة تساهميًا بحبات الدعم. على عكس كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، حيث ترتبط جميع جزيئات شحنة معينة بالعمود ، يستغل كروماتوغرافيا التقارب الارتباط المحدد لبروتين أو بروتينات برباط مثبت على حبات العمود.

على سبيل المثال ، إذا أراد المرء فصل جميع البروتينات في محلول الخلية الذي يرتبط بـ ATP من البروتينات التي لا تربط ATP ، فيمكن للمرء استخدام عمود به ATP متصل بخرز الدعم ويمرر العينة عبر العمود. كل البروتينات التي تربط الـ ATP "تلتصق" بالعمود ، بينما البروتينات التي لا تربط الـ ATP ستمر بسرعة من خلاله. يمكن بعد ذلك إطلاق البروتينات المرتبطة من العمود عن طريق إضافة محلول ATP الذي سيحل محل البروتينات المرتبطة عن طريق التنافس ، على البروتينات ، مع ارتباط ATP بمصفوفة العمود.

علامات الهيستيدين

تعتبر علامات الهيستيدين (His-tagging) نوعًا خاصًا من كروماتوغرافيا التقارب وهي أداة قوية لعزل البروتين المؤتلف من محلول الخلية. تعتمد علاماته على تغيير منطقة تشفير الحمض النووي للبروتين لإضافة سلسلة من ستة بقايا هيستيدين على الأقل إلى الطرف الأميني أو الكربوكسيل للبروتين المشفر. هذه العلامة مفيدة في تنقية البروتين الموسوم لأن السلاسل الجانبية للهستيدين يمكن أن ترتبط بأيونات النيكل أو الكوبالت. يعد فصل البروتينات الموسومة عن محلول الخلية أمرًا سهلاً نسبيًا (الشكل ( PageIndex {8} )). يسمح تمرير محلول الخلية الخام من خلال عمود متصل بالنيكل أو الكوبالت بالخرز للبروتينات التي تحمل علاماته "بالالتصاق ، "بينما تمر جميع بروتينات الخلية المتبقية بسرعة. يتم بعد ذلك التصفية من البروتينات الموسومة له عن طريق إضافة إيميدازول إلى العمود. يتنافس الإيميدازول ، الذي يشبه السلسلة الجانبية للحامض الهيستيدين ، مع البروتينات التي تحمل علاماته ويزيلها من العمود. على الرغم من أن البروتينات غير الموسومة في المحللة قد تحتوي أيضًا على الهيستدين كجزء من تسلسلها ، إلا أنها لن ترتبط بالعمود بقوة مثل البروتين الذي يحمل علامة His ، وبالتالي ، سيتم إزاحتها عند تركيزات إيميدازول أقل مما هو مطلوب لاستخراج هيس. -بروتين ذو علامات. من المثير للدهشة أن العديد من البروتينات الموسومة به يبدو أنها تعمل بشكل طبيعي على الرغم من الهيستيدينات المضافة ، ولكن إذا لزم الأمر ، يمكن قطع علامات الهيستيدين من البروتين المنقى عن طريق العلاج بالبروتياز الذي يزيل الهيستيدينات المضافة ، مما يسمح باستعادة البروتين المطلوب به التسلسل الأصلي.


الشكل ( PageIndex {8} ): تنقية كروماتوغرافية انجذابية للبروتين عن طريق وضع علامات على الهيستيدين ، صورة أليا كيم

HPLC

يعد الفصل الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (HPLC) أداة قوية لفصل مجموعة متنوعة من الجزيئات بناءً على استقطابها التفاضلي (الشكل ( PageIndex {9} )). شكل أكثر كفاءة من كروماتوغرافيا العمود ، يستخدم أعمدة ذات دعامات معبأة بإحكام وحبات صغيرة جدًا مثل تدفق المذيبات / المخازن المؤقتة عبر الأعمدة يتطلب ضغوطًا عالية. قد تكون الدعامات المستخدمة قطبية (فصل طور عادي) أو غير قطبية (فصل طور عكسي). في فصل الطور العادي ، تتم إزالة الجزيئات غير القطبية أولاً متبوعة بالمركبات الأكثر قطبية. يتم تبديل هذا الترتيب في كروماتوغرافيا الطور العكسي. من بين المرحلتين ، يتم استخدام الطور العكسي بشكل أكثر شيوعًا نظرًا لوجود ملفات تعريف كروماتوغرافية أكثر استنساخًا (عمليات فصل) تنتجها عادةً.


الشكل ( PageIndex {9} ): HPLC: المضخات على اليسار / العمود في المنتصف / الكاشف على اليمين. ويكيبيديا


تجزئة خليط البروتين المعقد بواسطة كروماتوغرافيا سائلة افتراضية ثلاثية الأبعاد بناءً على درجات الأس الهيدروجيني والملح المجمعة

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. اعثر على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.


تحدد هذه الاختبارات الخمسة المركبات الكيميائية الرئيسية المهمة بيولوجيًا. في كل اختبار ، خذ كمية صغيرة من المادة لاختبارها ، ورجها في الماء في أنبوب اختبار. إذا كانت العينة عبارة عن قطعة طعام ، فقم بطحنها ببعض الماء في مدقة وهاون لتفتيت الخلايا وإطلاق محتويات الخلية. العديد من هذه المركبات غير قابلة للذوبان ، لكن الاختبارات تعمل أيضًا على نظام تعليق جيد.

النشا (اختبار اليود):

  • يتم إضافة قطرتين من محلول اليود / يوديد البوتاسيوم إلى 2 سم مكعب تقريبًا من محلول الاختبار.
  • يشير اللون الأزرق والأسود إلى وجود النشا حيث يتم تكوين معقد النشا بوليوديد.
  • النشا قابل للذوبان بشكل طفيف في الماء ، لكن الاختبار يعمل بشكل جيد في التعليق أو كمادة صلبة.

تقليل السكريات (اختبار Benedict & # 8217s):

  • ستعمل جميع السكريات الأحادية ومعظم السكاريد (باستثناء السكروز) على تقليل كبريتات النحاس (II) ، مما ينتج عنه ترسبات من أكسيد النحاس (I) عند التسخين ، لذلك يطلق عليهم اسم السكريات المختزلة.
  • كاشف بنديكت هو محلول مائي من كبريتات النحاس (II) وكربونات الصوديوم وسيترات الصوديوم.
  • لحوالي 2 سم مكعب من الاختبار ، يضيف المحلول كمية متساوية من كاشف بنديكت. يُرج ويُسخن لبضع دقائق عند 95 درجة مئوية في حمام مائي.
  • الراسب يشير إلى تقليل السكر. يعطي لون وكثافة المادة المترسبة مؤشرا على كمية السكر المختزل الموجود ، لذا فإن هذا الاختبار شبه كمي.
  • اللون الأزرق الباهت الأصلي يعني عدم اختزال السكر ، أما المادة الخضراء المتعجلة فتعني القليل نسبيًا من السكر ، أما المادة المترسبة ذات اللون البني أو الأحمر فتعني وجود المزيد من السكر بشكل تدريجي.

السكريات غير المختزلة (اختبار Benedict & # 8217s):

  • يسمى السكروز بالسكر غير المختزل لأنه لا يقلل من كبريتات النحاس ، لذلك لا يوجد اختبار مباشر للسكروز.
  • ومع ذلك ، إذا تم تحللها أولاً (تم تقسيمها) إلى السكريات الأحادية المكونة لها (الجلوكوز والفركتوز) ، فسوف تعطي اختبار Benedict & # 8217s إيجابيًا.
  • لذا فإن السكروز هو السكر الوحيد الذي سيعطي اختبار بنديكت السلبي قبل التحلل المائي واختبارًا إيجابيًا بعد ذلك. قم أولاً باختبار عينة لتقليل السكريات لمعرفة ما إذا كانت موجودة قبل التحلل المائي. ثم ، باستخدام عينة منفصلة ، قم بغلي محلول الاختبار باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف لبضع دقائق لتحلل الرابطة الجليكوسيدية. قم بتعديل المحلول عن طريق إضافة كميات صغيرة من كربونات هيدروجين الصوديوم برفق حتى يتوقف عن الفوران ، ثم اختبره كما كان من قبل لتقليل السكريات.
  • قم أولاً باختبار عينة لتقليل السكريات ، لمعرفة ما إذا كانت موجودة قبل التحلل المائي. ثم ، باستخدام عينة منفصلة ، قم بغلي محلول الاختبار مع حمض الهيدروكلوريك المخفف لبضع دقائق لتحلل الرابطة الجليكوسيدية. قم بتعديل المحلول عن طريق إضافة كميات صغيرة من كربونات هيدروجين الصوديوم برفق حتى يتوقف عن الفوران ، ثم اختبره كما كان من قبل لتقليل السكريات.

الدهون (اختبار المستحلب):

  • لا تذوب الدهون في الماء ولكنها تذوب في الإيثانول. تستخدم هذه الخاصية في اختبار المستحلب.
  • لا تبدأ بحل العينة في الماء ، ولكن بدلاً من ذلك ، رج بعض عينات الاختبار بحوالي 4 سم مكعب من الإيثانول.
  • صب السائل في أنبوب اختبار من الماء ، تاركًا وراءه أي مواد غير منحلة.
  • إذا كانت هناك دهون مذابة في الإيثانول ، فسوف تترسب في الماء مكونة مستحلب أبيض غائم.

البروتين (اختبار بيوريت):

  • يضيف ما يقرب من 2 سم مكعب من محلول الاختبار حجمًا متساويًا من محلول البيوريت ، أسفل جانب أنبوب الاختبار.
  • تتشكل حلقة زرقاء على سطح المحلول ، وتختفي عند الاهتزاز ، ويتحول المحلول إلى أرجواني أرجواني ، مما يدل على وجود بروتين.
  • يرجع اللون إلى وجود معقد بين ذرات النيتروجين في سلسلة الببتيد وأيونات النحاس 2+ ، لذلك هذا حقًا اختبار للروابط الببتيدية.

آراء العملاء

إلسا لوندانيس حصلت على شهادتها الأكاديمية من جامعة أوسلو. عملت أستاذاً للكيمياء التحليلية منذ عام 1999. قام البروفيسور لوندانيس (بالمشاركة) بتأليف أكثر من 150 ورقة علمية ، وأشرف على أكثر من 100 طالب ماجستير وحوالي 20 طالب دكتوراه. تم انتخابها كعضو في الأكاديمية النرويجية للعلوم والآداب.

إل& متقطععلى Reubsaet حصل على شهادته الأكاديمية من جامعة أمستردام الحرة وجامعة أوتريخت. يعمل أستاذًا في تحليل الأدوية منذ عام 2005 في كلية الصيدلة بجامعة أوسلو. قام (شارك) بتأليف ما يقرب من. 70 ورقة علمية وأشرف على 40 طالب ماجستير و 8 طلاب دكتوراه. منذ عام 2012 ، أصبح البروفيسور روبسيت عضوًا في الهيئة الاستشارية لتحرير كروماتوغرافيا.

Tyge Greibrokk شغل منصب أستاذ الكيمياء التحليلية منذ عام 1975 ورئيس قسم الكيمياء في جامعة أوسلو. تقاعد من منصب أستاذ فخري في عام 2012. قام البروفيسور غريبروك (بالمشاركة) بتأليف أكثر من 250 ورقة علمية وأشرف على أكثر من 120 طالب ماجستير و 30 طالب دكتوراه. تم انتخابه عضوًا في الأكاديمية النرويجية للعلوم والآداب ، وعضوًا فخريًا في الجمعية الكيميائية النرويجية ، وحصل على العديد من الجوائز والأوسمة وعمل كمحرر لمجلة الفصل العلمي لعدة سنوات.


إجراء تجزئة Benchtop

يشتمل القسم التالي على وصف مفصل لبروتوكول تجزئة الفوق. لدعم التطبيق ، تم توضيح إجراء التجزئة في الشكل 2. في الخطوة الأولى ، تم تعليق ما يقرب من 10 إلى 20 مجم من مادة الأوراق المطحونة جيدًا والمجففة بالتجميد في 10 مل من الهبتان المبرد مسبقًا (4 & # x000B0C) (C)7ح16 & # x0201C7H & # x0201D) - رباعي كلورو الإيثيلين (C.2Cl4 & # x0201CTCE & # x0201D) - خليط بكثافة & # x003C1 = 1.3 جم سم & # x022123 (نسبة 7H: TCE = 0.484: 1). في الخطوة الثانية ، تم طحن المادة النباتية المعلقة على الجليد في مطحنة نسيج زجاجية سعة 15 مل مع ملاط ​​محكم (Dounce Tissue Grinder ، Wheaton USA) من أجل تقليل متوسط ​​حجم الجسيمات للمادة النباتية (الشكل 2 الخطوات) 1 & # x020134). بعد التجانس ، تم وضع القوارير الزجاجية في حمام بالموجات فوق الصوتية مملوء بالماء المثلج (Bandelin Sonorex ، Typ RK 100 ، 50/60 هرتز) ، وصوتها لمدة 10 دقائق. كل دقيقتين ، تم فحص العينات للتأكد من أنها ظلت باردة بالجليد. بعد الصوتنة ، كان متوسط ​​حجم الجسيمات في نطاق نانومتر إلى ميكرومتر منخفض (الصورة التكميلية 1). تم ترشيح المعلق الصوتي من خلال 22 & # x0201325 & # x003BCm شاش نايلون مسامي (Miracloth ، Calbiochem) في أنبوب تفاعل سعة 50 مل. تم شطف المطحنة الزجاجية بـ 10 مل من الهبتان المجهز مسبقًا والذي تم ترشيحه بعد ذلك من خلال الشاش وتجميعه مع العينة المرشحة. تم الطرد المركزي المعلق المرشح المجمع بـ 4400 جم عند 4 & # x000B0C لمدة 10 دقائق (الشكل 2 خطوات 5 & ​​# x020137). تم التخلص من المادة الطافية بأكبر قدر ممكن من الكفاءة وتم إعادة تعليق الحبيبات المتبقية ، التي لا تزال تحتوي على ما يقرب من 50 & # x003BCL من المادة الطافية ، في 1 مل من رباعي كلورو إيثيلين وتم نقلها إلى أنبوب تفاعل سعة 2 مل (الشكل 2 الخطوة 8). تم إجراء تقدير المادة الطافية المتبقية في الحبيبات باستخدام ماصة وهي ضرورية لتقريب كثافة التدرج الأول بشكل موثوق (الكسر & # x0201Cf ، & # x0201D المشار إليها بـ & # x003C1 & # x0003E 1.55). تم صوت العينات لمدة 10 دقائق في حمام بالموجات فوق الصوتية بالماء المثلج ، وبعد ذلك تم الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير فوق الطاولة مع 21100 جم عند 4 & # x000B0C لمدة 10 دقائق (الشكل 2 الخطوات 9 & # x0201311 الصور في الصور التكميلية 1 ، 2). بعد الطرد المركزي ، كان هناك انقسام إلى طاف (& # x0201Cs & # x0201D) وكريات (& # x0201Cp & # x0201D). خطوة 12 ثانية (الشكل 2) ، تم نقل المادة الطافية إلى أنبوب رد فعل جديد سعة 2 مل وتم تخفيفه باستخدام هيبتان وفقًا لخطوة التدرج التالية. تعتمد كمية الهبتان المضافة على الكثافة المرغوبة التالية وتم حسابها كما هو موضح في المعادلة (1). تحتوي الصيغة على مجموع التركيزات الكتلية لـ أنا مكونات المحلول مقسومًا على الحجم الكلي:

هنا، مأنا يمثل الكتلة ، الخامسأنا الحجم و الخامسالمجموع الحجم الكلي للحل.

الشكل 2. نظرة عامة تخطيطية لإجراء تجزئة الفوق. حصاد وطحن مادة الأوراق والصوتنة (خطوات 1 & # x020135) الترشيح وجمع المواد وفصل الكسور (خطوات 6 & # x020139) الطرد المركزي (الخطوة 10) سير عمل طاف متكرر (& # x0201Cs & # x0201D) بكثافة جديدة ، صوتنة وطرد مركزي (خطوات 12 & # x0201315s) الانفصال عن الحلقة الطافية (الخطوة 13 لتر) إعادة تعليق الحبيبات (& # x0201Cp & # x0201D) ، وتوليد قسامات وغسل (خطوات 12 & # x0201324p) تجفيف العينة (الخطوة 15). 7 ح، n-Heptane TCE ، رباعي كلورو إيثيلين.

على سبيل المثال ، بالنظر إلى حجم طاف يبلغ 1.050 مل بكثافة 1.55 جم سم & # x022123 والكثافة المرغوبة 1.45 جم سم & # x022123 في خطوة الطرد المركزي التالية ، فإن إدخال جميع الأحجام والكثافات في المعادلة (1) يكشف عن الحجم x من هيبتان (& # x003C1 = 0.68 جم سم & # x022123) والتي يجب إضافتها:

حل ل x يكشف x = 0.137 مل ، أي 0.137 مل من الهبتان يجب أن يضاف إلى المادة الطافية.

تم صوت أنبوب التفاعل بالكثافة الجديدة مرة أخرى في حمام جليدي لمدة 10 دقائق وبعد ذلك تم طرده باستخدام 21100 جم عند 4 & # x000B0C لمدة 10 دقائق (الشكل 2 ، الخطوات 13 & # x0201314s الصور في الصورة التكميلية 2). بعد ذلك ، بدأ الإجراء التكراري مرة أخرى للكسر الثاني واستمر حتى الوصول إلى الكثافة النهائية (الشكل 2 ، الخطوة 15 ثانية). يتم توفير أمثلة لتدرجات الكثافة المختلفة في الملاحق (البيانات التكميلية 1). تم إذابة الكريات المتبقية بعد الخطوة 12s في 900 & # x003BCL هيبتان - رباعي كلورو إيثيلين وفقًا لكثافة الجزء المقابل وتم تقسيمها إلى ثلاثة أجزاء فرعية. تم غسل هذه الأجزاء الفرعية الثلاثة باستخدام 1 مل من الهبتان وطردها بالطرد المركزي لمدة 3 دقائق باستخدام 21100 جم عند 4 & # x000B0 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم التخلص من 800 & # x003BCL من المادة الطافية (الشكل 2 ، الخطوات 12 & # x0201314p). تمت إضافة المادة الطافية للكسر الأخير & # x0201Cl & # x0201D (رقم الكسر 1) إلى كسور فرعية ، على سبيل المثال ، تمت إضافة هيبتان 3 و 500 & # x003BCL ، بالطرد المركزي عند 21،100 جم 4 & # x000B0C لمدة 3 دقائق وكان الطاف أبقى (الشكل 2 ، الخطوة 13 لتر). تم تجفيف العينات في مكثف فراغ (LaboGene & # x02122 ، الدنمارك) وتخزينها في & # x0221220 & # x000B0C حتى استخدامها لقياس نشاط الإنزيم وتحليل التمثيل الغذائي (الشكل 2 ، الخطوة 15).

بعد إجراء التجزئة ، تم تحديد أنشطة إنزيم الواسم بطريقة القياس الضوئي ، أي نشاط نشاط بيروفوسفاتيز البلاستيدي ، يوريدين خلوي 5 & # x02032-ثنائي فسفوغلوكوز بيروفوسفوريلاز وفوسفاتاز حامضي فاكولار. أخيرًا ، تم تحديد التوزيع النسبي لأنشطة إنزيم الواسم للبلاستيد ، العصارة الخلوية ، والفجوة مما سمح بالارتباط مع مستويات المستقلب.

في هذه المرحلة ، نود إبداء بعض الملاحظات الفنية العامة التي نعتقد أنها ذات أهمية مركزية لسير عمل ناجح: تم تبريد جميع المذيبات المستخدمة مسبقًا ، وتم تنفيذ العمل دائمًا على الجليد وتحت غطاء الدخان ويجب إيلاء اهتمام خاص لذلك مع العلم أن العينات غير ملوثة بالماء. كانت جميع المطاحن الزجاجية المفتوحة مغطاة بورق الألمنيوم عندما لم يتم استخدامها. قد يختلف تصميم وتطبيق تدرجات الكثافة اختلافًا كبيرًا بين الأنواع والأعضاء والأنسجة وأنواع الخلايا. في حين أنه من الصعب التنبؤ بالتدرج الذي يجب تطبيقه على نسيج أو نوع خلية غير مميز ، فإننا نوصي بالبدء بتدرج خطي يغطي نطاق كثافة كبير ، على سبيل المثال ، تدرج يتراوح من 1.2 إلى 1.55 جم سم & # x022123 (للتفاصيل مثال التدرجات ، يرجى الرجوع إلى البيانات التكميلية 1). نتائج أول ستشير قياسات علامة الإنزيم بعد ذلك إلى ما إذا كان التدرج الخطي المختار مناسبًا لفصل واضح أو ما إذا كانت المزيد من خطوات الكثافة ضرورية لحل نطاق كثافة معين.


تعريف الكروماتوغرافيا بالترشيح الهلامي

يمكن تعريف كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي بأنها طريقة الكروماتوغرافيا التي تستخدم المسامية حبات هلام محددة المسامية لعزل المكونات حسب أحجامها الجزيئية. هذه التقنية تحافظ بشكل أساسي على الجسيمات أو تستبعدها اختلاف الحجم، وهذا هو السبب في أنه يُعرف أيضًا باسم استبعاد الحجم أو كروماتوغرافيا الاستبعاد الهلامي. يساعد بشكل رئيسي في عزل الجزيئات الحيوية مثل البروتينات والببتيدات وقليل النوكليوتيدات.

مراحل الكروماتوغرافيا بالترشيح الهلامي

المرحلة المتنقلة: ال مذيب يمر من خلال العمود هو المرحلة المتنقلة. يجب تخفيف عينة الاختبار في مذيبات عضوية مناسبة ، ثم ترشيحها وتمريرها أخيرًا إلى العمود. يتم فصل خليط متعدد المكونات في العمود.

مرحلة ثابتة: ال عمودي معبأة مع هلام صغير يسهل اختراقه الخرز بمثابة المرحلة الثابتة. سيفاديكس هيدروكسي بروبيل ، بولي أكريلاميد متصالب ، هلام الاغاروز وتستخدم بشكل أساسي لفصل الجزيئات الحيوية المختلفة.

مبدأ

يعتمد مبدأ كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بشكل أساسي على عزل الجزيئات الحيوية بناءً على الاختلافات في الوزن الجزيئي الغرامي أو بحجم. تستخدم تقنية الترشيح الهلامي حبيبات جل كروية ذات مسامية محددة مثل مواد التعبئة والتغليف في العمود اللوني.

في كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، تمر المكونات الموجودة في خليط سائل عبر عمود من حبيبات الهلام المسامية ، حيث يمر بعضها أزل في وقت سابق أو في وقت لاحق من خلال العمود ، اعتمادًا على حد الشطف. ال حد الشطف هو العامل الذي يقرر الاحتفاظ أو استبعاد الجزيئات التي يتم التصفية من خلال العمود.

تمتلك الجزيئات وزنًا جزيئيًا مرتفعًا مقارنةً بحد الشطف الذي سيتم التخلص منه مبكرًا ، في حين أن تلك الجزيئات التي تمتلك وزنًا جزيئيًا منخفضًا أو حجمًا أقل من حد الشطف سوف يتم التخلص منها لاحقًا. لذلك ، بهذه الطريقة ، يتم فصل الجسيمات في كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي.

إجراء

تتضمن عملية كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي الخطوات المتسلسلة التالية:

  1. أولاً ، يتم تحضير عمود من حبيبات الهلام الكروية من أجل كروماتوغرافيا ترشيح الهلام.
  2. السرير المعبأ متوازن مع المخزن المؤقت.
  3. ثم يتم التخلص من محلول الاختبار (الطور المتحرك) من خلال العمود.
  4. بعد ذلك ، سوف تدخل الجسيمات الموجودة في عينة الاختبار أو تنتشر خارج مصفوفة الهلام المسامية (المرحلة الثابتة).
  5. سوف تدخل الجزيئات التي لها حجم جزيئي صغير في مسام الهلام ، أي أن الجزيئات الصغيرة ستغطي مسارًا أطول أو تبقى لفترة أطول على العمود.
  6. تمتلك الجزيئات حجمًا جزيئيًا كبيرًا لا يمكنها الوصول إلى مسام حبة الهلام أو المرور بسهولة عبر العمود.
  7. وهكذا ، يحدث فصل الجسيمات على فترات مختلفة ، باتباع عزل وتحديد المكونات المفصولة.

التجزيء والتحلية هما الطريقتان اللتان تحققان فصل المكونات في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.

تحلية: يتم التخلص من الجزيئات الثقيلة ، عن طريق الحفاظ على حد الاستبعاد للجيل أصغر ، بحيث يمكن للجزيئات الأصغر أن تحبس في مسام الهلام ، بينما تنفصل الجزيئات الأكبر.

تجزئة: في هذه الطريقة ، يتم عزل الجزيئات المستهدفة الموجودة داخل مصفوفة الهلام ، والتي يجب أن يكون حجمها الجزيئي ضمن نطاق تجزئة الهلام.

نتائج

تعتمد الجزيئات المنفصلة عن وحدة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي على توزيع حجم الهلام الصغير الذي يسهل اختراقه. يساعد على بناء ملف منحنى المعايرة وهذا بدوره يحدد الوزن الجزيئي لتحليل غير معروف في العينة من خلال مقارنة الوزن الجزيئي للتحليل المعروف.

التطبيقات

  1. يعتبر الفصل اللوني لتغلغل الهلام طريقة قوية لـ طهارة من الجزيئات الحيوية مثل الإنزيمات والسكريات والأحماض النووية والبروتينات وما إلى ذلك.
  2. يمكن لوحدة الترشيح الهلامية التمكين إعادة التشبع من البروتينات المشوهة.
  3. يتم استخدامه في تجزئة البروتين التجارب.
  4. من خلال استخدام كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، يمكن فحص الوزن الجزيئي للجزيئات المفصولة.
  5. إنها طريقة يمكنها فحص البنية الرباعية للبروتينات النقية.

مزايا

  • يمكن أن يفصل الترشيح الهلامي الجزيئات الحيوية ، الحساسة لتغير الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتركيز أيونات المعادن وما إلى ذلك.
  • لا تلتصق الجسيمات بالوسط اللوني ، كما هو الحال في كروماتوغرافيا التبادل الأيوني.
  • يمكن تفسير النتيجة داخل ملف الحد الأدنى من الوقت.
  • يعطي فصل واضح المعالم.
  • كمية صغيرة من عينة الاختبار كافية لاستنتاج النتائج.
  • يمكن ضبط معدل التدفق.

محددات

  • يجب ترشيح عينة الاختبار قبل تمريرها عبر عمود الترشيح الهلامي لمنع حدوث تسرب انسداد من الجسيمات داخل الجهاز.
  • يجب أن تكون الأداة خالية من الغبار والمواد الجسيمية الأخرى التي قد تتداخل مع تفسير النتيجة.

استنتاج

لذلك ، فإن كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي هي تقنية تعتمد على الوزن الجزيئي الغرامي من الجزيء الحيوي ، حجم التوزيع من حبات هلام و حد الشطف. حركة الجزيئات الصغيرة أبطأ من الجزيئات الكبيرة ، بسبب الانتشار السريع في المسام. على العكس من ذلك ، فإن الجسيمات الأكبر حجمًا غير قادرة على الانتقال إلى المسام ، لذا تتحرك بسرعة أكبر ويتم التخلص منها.


ما هو اللوني؟

إذا كنت تعمل في الصناعة الكيميائية ، فلا بد أنك سمعت عن تقنية الكروماتوغرافيا. على الرغم من كونه إجراءً شائعًا ، لا يزال العديد من الأشخاص غير مألوفين لما هو اللوني وكيف يعمل بالضبط. إذا كنت مرتبكًا أيضًا بشأن الموضوع ، فقد وصلت إلى المكان الصحيح. تتضمن هذه المقالة جميع التفاصيل حول اللوني. لنبدأ مع معنى وتعريف اللوني.

معنى اللوني

وفقًا لتعريف القاموس ، يعد اللوني طريقة لفصل مكونات المحلول (غاز أو سائل) من خلال استغلال الخصائص المختلفة للجزيئات المختلفة. تستخدم التقنية طورًا متحركًا (غازًا أو سائلًا) لنقل المحلول المراد تحليله من خلال الطور الثابت (صلب أو سائل) الذي يمتص أو يعيق المكونات المختلفة للمحلول بدرجات مختلفة وبالتالي يتسبب في فصلها كطبقات مختلفة. إنها أداة لا تقدر بثمن في أيدي علماء التحليل لفصل وتقدير المكونات في خليط من المركبات العضوية.

تاريخ وأساسيات اللوني

تعود أصول هذه التقنية إلى العمل الرائد لميخائيل تسويت الذي فصل أصباغ النباتات في عام 1900 باستخدام عمود زجاجي معبأ. نظرًا لأن الأصباغ المنفصلة كانت ملونة بشكل مختلف وتم فصلها كأشرطة مميزة ، فقد تم صياغة التقنية على أنها كروماتوغرافيا تعني الفصل بواسطة الألوان.

على مر السنين ، تطور الكروماتوغرافيا وتطورت إلى إصدارات مثل HPLC و GC و HPTLC و SFC والتي تعتمد جميعها حتى يومنا هذا على فصل مكونات الخليط من خلال تفاعلات فيزيائية كيميائية انتقائية والتقسيم بين المرحلتين الثابتة والمتحركة.

لماذا نستخدم الكروماتوغرافيا؟

منذ تطوره ، وجد الكروماتوغرافيا استخدامًا واسعًا في فصل مكونات المخاليط التي تتراوح من أبسط الغازات إلى معظم الخلائط الهيدروكربونية المعقدة التي تحتوي على مئات المركبات المختلفة. يمكن أن تكون العينات غازية أو سائلة أو حتى مواد صلبة قابلة للذوبان بسهولة في مذيبات مناسبة.

نظرًا لتعدد استخداماتها ، تغطي التطبيقات مجموعة كاملة من المركبات الكيميائية التي لها خصائص متنوعة مثل نطاق الغليان والأوزان الجزيئية والتقلبات والثبات الحراري. الكروماتوغرافيا الغازية ، الكروماتوغرافيا السائلة ، كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، كروماتوغرافيا السوائل الحرجة للغاية والتقنيات الواصلة مثل GC - MS ، و LC - MS تغطي عددًا كبيرًا من التطبيقات في مجالات متنوعة مثل المستحضرات الصيدلانية وتطوير المواد والأطعمة والمنتجات البترولية والطب الشرعي التحقيقات التي تتطلب دقة عالية للغاية وحدود الكشف.

بعض تطبيقات الكروماتوغرافيا في الصناعات المختلفة هي:

الصناعة الكيماوية
  • كشف الملوثات في المبيدات والزيوت
  • اختبار عينات المياه
  • فحوصات جودة الهواء
  • تطبيقات عديدة في علوم الحياة
صناعة الادوية
  • أخذ تكوين العنصر ووزنه الجزيئي لفصل المركبات
  • أثناء عملية تطوير الدواء
  • الكشف عن المواد الكيميائية أو العناصر النزرة في العينات المختلفة مع التحليل المناسب
  • فحص نقاء الخليط
  • تحديد المركبات غير المعروفة
صناعة الطب الشرعي
الصناعات الغذائية
  • تحديد القيم الغذائية للمنتجات الغذائية وجودتها
  • الكشف عن المضافات وفساد الطعام
دراسات البيولوجيا الجزيئية
  • تستخدم صناعة الوقود والعمليات الكيميائية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية HPLC للتنقية وعملية التجزئة
  • يدرس علم الأيض والبروتيوميات من خلال تقنيات كروماتوغرافيا محددة
  • أبحاث الحمض النووي باستخدام طرق كروماتوغرافيا محددة

هذه ليست سوى التطبيقات الشائعة للكروماتوغرافيا. يتم استخدام هذه التقنية في أماكن وصناعات مختلفة أخرى.

العمل الأساسي للكروماتوغرافيا

ستعتمد العملية الدقيقة للكروماتوغرافيا على المكان الذي تريد استخدامه والطريقة التي تختارها (سيتم استكشافها لاحقًا في المقالة). ومع ذلك ، لا يزال بإمكاننا تحديد إجراء أساسي يتكون من أربع خطوات بسيطة:

  • الخطوة 1: التعرض الدقيق لكمية معينة من التحليلات لتيار الطور المتحرك الذي كان قيد التشغيل بالفعل.
  • الخطوة 2: بعد ذلك ، يتم تنفيذ التحليل خلال المرحلة الثابتة بمساعدة المرحلة المتنقلة.
  • Step 3: Finally, the separation takes place when the analyte components react with the stationary phase at different levels. Some of them react more, while others don’t.
  • Step 4: The separated out analyte components are then again carried out by the mobile phase. It then takes the components to a separate instrument. There, they get quantified with the proper detection of their presence.

And in these four steps, the process gets complete. We can say that chromatography is divided into three basic components: Mobile Phase, Stationary Phase, and Separated Molecules.

Let’s now get into the details of the use of different parts of chromatography.

Chromatography Parts

The four steps aren’t enough to understand how chromatography works. You also need to know about the different elements of the process, along with their working. Only then will you be able to learn the concept.

Chromatography Columns

Separation of sample components before detection is the essence of chromatographic techniques. A chromatographic system uses a column to achieve the desired separation. A column comprises of a tube packed with a stationary phase on which separation takes place based on physico – chemical interactions of separating compounds with the stationary phase. The mobile phase or the carrier gas elutes less weakly retained components first followed by more strongly retained components.The column dimensions and composition is based on the chromatographic technique selected and the degree of required separation. In general HPLC columns are shorter and wider than GC columns.

Chromatographic Detectors

After separation the individual components reach the detector which provides response in terms of the area or peak height depending on the amount of the eluting compound. Each chromatographic separation technique offers a range of detectors depending on the nature of eluting compounds.

Detection can be specific for a particular compound or a range of compounds or it can depend on some physical properties such as reflective index of the mobile phase. Such detectors are referred to as bulk property detectors in comparison to selective or specific detectors.

Chromatographic Data

Chromatographic separations appear as peaks in the chromatogram except for thin-layer chromatography for which separate zones are seen on the plate. Chromatographic peaks are separated in time in the chromatogram depending on the nature of separating compounds and the separation efficiency of the column. Sharp well resolved peaks indicate high degree of column resolution whereas broad or overlapping peaks are indicative of poor resolution.

Each peak represents a sample component and is characterized by its retention time under defined operating conditions. For purposes of quantification the peak height or more accurately the area under the peak defines the amount of the component present in the mixture.

Quantitation methods require percentage composition of a particular component in the mixture and such estimations are made on the presumption that the detector responds to all the components equally and peaks are generated for each compound.

Quite often the amount of analyte is specified in relation to another compound which is referred to as a reference standard having established traceability. Such compounds should be available in pure form and have chemical identity which is same or close to the identity of the analyte to be determined.

Modern-day analytical systems come equipped with sophisticated application softwares which are capable of operational control, data interpolation and calculations to achieve the desired results.

Common Chromatography Methods

A few general chromatography methods that are divided based on the separation basis of the elements are:

Now you have the answer to the basic question ‘What is chromatography?’you will be eager to know more about the chromatographic techniques .Simply register to our free courses and advanced certificate programmes listed under courses on the main menu.


Paper Chromatography Report

مقدمة
The purpose of this experiment is to observe how chromatography can be used to separate mixtures of chemical substances. Chromatography serves mainly as a tool for the examination and separation of mixtures of chemical substances. Chromatography is using a flow of solvent or gas to cause the components of a mixture to migrate differently from a narrow starting point in a specific medium, in the case of this experiment, filter paper. It is used for the purification and isolation of various substances. A chromatographically pure substance is the result of the separation. Because purification of substances is required to determine their properties, chromatography is an indispensable tool in the sciences concerned with chemical substances and their reactions.

Chromatography is also used to compare and describe chemical substances. The chromatographic sequence of sorbed substances is related to their atomic and molecular structures. A change in a chemical substance produced by a chemical or biological reaction often alters the solubility and migration rate. With this knowledge, alterations or changes can be detected in the substance.

In all chromatographic separations, there is an important relationship between the solvent, the chromatography paper, and the mixture. For a particular mixture, the solvent and the paper must be chosen so the solubility is reversible and be selective for the components of the mixture. The main requirement, though, of the solvent is to dissolve the mixture needing to be separated. The porous paper used must also absorb the components of the mixtures selectively and reversibly. For the separation of a mixture, the substances making up the mixture must be evenly dispersed in a solution, a vapor, or a gas. Once all of the above criteria have been met, chromatography can be a simple tool for separating and comparing chemical mixtures.

فرضية
Paper can be used to separate mixed chemicals.

المواد
The materials used for this lab are paper, pencil, eraser, filter paper, test tube, rubber stopper, paper clip, metric ruler, black felt-tip pen, and a computer.

أساليب
The first step of the method is to bend a paper clip so that it is straight with a hook at one end. Push the straight end of the paper clip into the bottom of the rubber stopper. Next, you hang a thin strip of filter paper on the hooked end of the paper clip. Insert the paper strip into the test tube. The paper should not touch the sides of the test tube and should almost touch the bottom of the test tube. Now you will remove the paper strip from the test tube. Draw a solid 5-mm-wide band about 25 mm from the bottom of the paper, using the black felt-tip pen. Use a pencil to draw a line across the paper strip 10 cm above the black band.

Pour about 2 mL of water into the test tube. The water will act as a solvent. Put the filter paper back into the test tube with the bottom of the paper in the water and the black band above the water. Observe what happens as the liquid travels up the paper. Record the changes you see. When the solvent has reached the pencil line, remove the paper from the test tube. Measure how far the solvent traveled before the strip dries. Finally, let the strip dry on the desk. With the metric ruler, measure the distance from the starting point to the top edge of each color. Record this data in a data table. Calculate a ratio for each color by dividing the distance the color traveled by the distance the solvent traveled.

نتائج
The results of the experiment are shown in a chart and a graph.

Color of Ink (listed in order) Distance each Color Traveled (mm) Distance Solvent Traveled (mm) Ratio Traveled
(Distance color moved divided by distance solvent moved)
Yellow 70 mm 111 mm .63
Pink 82 mm 111 mm .74
Red 101 mm 111 mm .91
Purple 110 mm 111 mm .99
Blue 111 mm 111 mm 1.0

1. How many colors separated from the black ink? Five colors separated from the black ink: yellow, pink, red, purple, and blue.

2. What served as the solvent for the ink? Water served as the solvent for the ink. As the solvent traveled up the paper, which color of ink appeared first? The color orange first appeared as the solvent traveled up the paper.

3. List the colors in order, from top to bottom, which separated from the black ink. The colors separated in this order, from top to bottom: blue, purple, red, pink, and then yellow.

4. In millimeters, how far did the solvent travel? The solvent traveled 111 mm.

5. From your results, what can you conclude is true about black ink? Black ink is a mixture of several different colors.

6. Why did the inks separate? The inks separated because the black ink was a mixture of different pigments with different molecular characteristics. These differences allow for different rates of absorption by the filter paper.

7. Why did some inks move a greater distance? The ink least readily absorbed by the paper would then travel the farthest from the starting mark. You can conclude from this information that the different pigments were absorbed at different rates.

Error Analysis
Possible errors could include inaccurate measurements of the distances traveled by the inks and mistakes when calculating the ratio traveled by the water and colors. If a longer test tube was used, a longer strip of filter paper could have been used. This may have changed the ratios. Another color may have been present, but not detected because of the filter paper length.

استنتاج
The proposed hypothesis was correct. The paper chromatography did show that black ink could be separated into various colors. The black ink gets its color from a mixture of various colored inks blended together. The first color of ink to appear on the filter paper was yellow followed by pink, red, purple then blue. The colors separated the way they did because of the differences in their molecular characteristics, specifically, their solubility in water and their rate of absorption by the paper. The most soluble and readily absorbed ink color was the yellow. The least soluble and least absorbable ink color was the blue.


About the Journal

The Journal of Chromatography and Separation Techniques is a peer-reviewed (refereed), academic, open-access, international scientific journal which provides a global scholarly platform to scientists, academicians and researchers to disseminate knowledge to the tertiary end users in the form of critical and informed articles related to separation science.

The Journal of Chromatography and Separation Techniques publishes research papers and critical reviews on all aspects of separation science including developments in separation science relevant to biology and biomedical research. The scope includes Chromatography and related techniques, Electrophoresis, Extraction, Evaporation, Centrifugation, Crystallization, Distillation, Decantation, Sublimation, Magnetic Separation, Precipitation, Filtration, Adsorption, Thermo-gravimetric analysis, Mass Spectrometry, Micro-analytical techniques, Electro-migration techniques, sample preparation, Spectroscopic Methods, Chiral Separations, Nano-fluidic and Micro-fluidic Separations, Ion Suppression and Matrix-effects in separation, The qualitative and quantitative analysis of biopolymers including monoclonal antibodies, proteins, peptides (post-translational modifications), nucleic acids and glycans The comparative analysis of biological systems using lipidomics, metabolomics, genomics, proteomics and other "omics" approaches Clinical analysis, toxicological analysis, doping analysis, therapeutic drug monitoring, metabolism, veterinary applications, analysis of environmental contaminants in biological systems The screening and profiling of cells, tissues, body fluids, biological matrices and systems analysis of endogenous compounds and biomarkers Identification of new bioactive compounds hyphenated techniques and other multi-dimensional techniques.

The Journal of Chromatography and Separation Techniques accepts manuscripts on all aspects of separation science theory and methodology, instrumental developments and analytical and preparative applications. Developments related to preparative separations for the isolation and purification of components of biological systems are accepted, including chromatographic and electrophoretic methods, affinity separations and other preparative approaches.

Novel research and developments like improved analytical performance, combination of analytical techniques or a new approach to the separation are given importance. Reports of analytical methods for compounds in early pharmaceutical development are considered if the authors can demonstrate the broader significance of the methodology involved. Quality control analyses of bulk drugs, natural products and pharmaceutical formulations are also considered.

All submitted manuscripts are subjected to a stringent, rigorous peer-review process and are carefully evaluated based on originality and clarity of exposition.


8.2: Fractionation and Chromatography Techniques - Biology

An overview of subcellular fractionation methods.

Separation of cellular compartments from one another is an important step for studying a specific intracellular structure or organelle or protein, or to assess possible associations between these macromolecular structures. Subcellular fractionation uses one or more of the properties of each compartment, such as buoyant density, surface charge density, size and shape, and is mainly based on differential centrifugation in media of high viscosity at 4°C. Media used for differential centrifugation are mainly sucrose, mannitol, glycerol, Ficoll 400 (a polymer of sucrose), Percoll (a type of colloidal silica) and iodixanol (OptiPrep, e.g., Hela or THP1 cell fractionation for cGAS activity assay [4] ). Sucrose is widely used because it is inexpensive. But they all have their advantages and limitations, which are discussed in detail by Harford and Bonifacino, 2011. Mainly these methods will be discussed here, with a preference for the ones that are easily accessible to most labs and are less time-consuming, as speedy recovery is vital. Gel filtration, affinity chromatography, electrophoresis or selective density-shift perturbation can also be used. Variations in the conditions of the available protocols are dependent on the organelle, tissue or cell type and equipment used, and it is highly recommended to read the cited references for full details of each procedure. In the end, the purity and the yield of the fractionation should be assessed by detection of distinct markers in each collected fraction during the entire procedure. The isolation methods for biological condensates and exosomes are discussed elsewhere.

Sequential centrifugation can be used to prepared endosomes. For example, neuronal endosomes were obtained through first lyzing neurons with 20 times of syringe aspiration in lysis buffer (250 mM sucrose, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 1mM EGTA) along with protease inhibitor mixture and then going through sequential centrifugation at 1000 x g for 10 min, 16,000 x g for 20 min, and 100,000 x g for 60 min at 4°C [5].

Synaptosomes, or isolated nerve terminals, are commonly used to study the structure, molecular mechanisms and functions of synapses. The general procedure for synaptosomal preparations involves the homogenization of brain tissue followed by differential centrifugation of the homogenate at low speed (600g or 1000g) to pellet tissue debris and then centrifugation of the resulting supernatant at high speed (20,000g or 14000g) to separate mitochondria and synaptosomes [1, 6]. Figure 1 shows a schematic diagram of the general methods for synapse and synaptosome preparations. Synaptosomes can be further homogenized and centrifuged to separate synaptosomal membranes from synaptosomal cytosol [7].

Synaptosome preparations obtained by slight variations of the method described above have already been used for several types of studies in the neuroscience field, especially studies that determine the functions of specific synaptic proteins [8-10], proteomic and phosphoproteomic analysis [11, 12], and studies of disease-specific genes [8, 13] and local protein synthesis in neuronal pre- and postsynaptic compartments [14]. Moreover, synaptosomes have been labeled with various compounds and used as platforms for loading synaptic vesicles with desired markers [15].

Commercial reagents that facilitate synaptosome isolation are also available, but so far, less popular, most probably due to higher cost. Syn-Per Synaptic Protein Isolation Reagent from Thermo Scientific has been used by several groups [16-19]. Sigma Aldrich’s Synaptic Vesicles Isolation Kit SV0100 was also used [20, 21], but seems to have been discontinued (Sigma Aldrich Catalog as of Oct 11th, 2018). Already prepared synaptosomal fractions can be purchased from Synaptic Systems (SySy).

Cytoplasmic, nucleoplasmic and chromatin fractions can be easily prepared from a pellet of cultured cells [2]. Cells are resuspended in a buffer containing 0.34 M sucrose, 10% glycerol and low concentration of a mild detergent (0.1% Triton X-100) as well as K + and Mg +2 (which protect the nuclei from breaking) and the nuclei are pelleted by low-speed centrifugation while the supernatant is kept as the cytoplasmic fraction. Next, nuclei are lysed in a buffer containing chelating agents EDTA and EGTA and the insoluble chromatin fraction is pelleted by low-speed centrifugation while the supernatant is the nucleoplasmic fraction [2] (Figure 2).

Some researchers use a 'quick and dirty' preparation of chromatin with its associated proteins from the cytoplasm/nucleoplasm. This is simply performed by lysing the cells in a lysis buffer containing 1% Triton X-100. In this buffer, chromatin and some cytoskeletal structures are insoluble and they can be recovered by centrifugation. The pellet can be resuspended in the buffer of choice e.g., Laemmli for SDS PAGE [22].

A cytosol-enriched fraction can be prepared with 250 mM sucrose and without any detergents through centrifugation at 2000g to remove nuclei and cellular debris and ultracentrifugation at 75,000g to get rid of other cellular components [23].

  1. Cell pellets, grown as a monolayer or in suspension, are homogenized in a homogenization buffer containing MgCl2 and KCl. Later, sucrose is added up to 0.25 M and the nuclei are pelleted by low-speed centrifugation (1000 g). Second centrifugation of the supernatant at 5000 g will sediment the mitochondria. The pellet is resuspended in a medium containing sucrose and Mg +2 and is subjected to a few gentle strokes in a Dounce homogenizer. The last centrifugation step at 5000 g will enrich mitochondria which can be resuspended in Tris buffer containing 0.25 M sucrose or in the buffer of preference for subsequent analyses (e.g., Laemmli) [24].
  2. Yeast cells are treated with zymolase to break the hard outer wall and produce spheroplasts, which are washed in a sorbitol buffer. The pellet is resuspended in homogenization buffer containing 0.6 M mannitol and cells are lysed by a few strokes in a Dounce homogenizer. Nuclei are removed by low-speed centrifugation, while the cytoplasm-containing supernatant is centrifuged in a fixed-angle rotor at 6500 g to pellet mitochondria.

Additionally, there are protocols that utilize density-gradient separations which provide purer mitochondrial fractions, but they are more time-consuming and are avoided. Despite the "contamination" by lysosomes and peroxisomes in fractions obtained by the differential centrifugations, they are the method of choice. Therefore, the desired purity determines which the most suitable method is. For example, if metabolic studies are of interest, differential centrifugation is preferred alternatively, if the exact localization of a protein is under investigation or samples of the purest form are a necessity, e.g., in proteomics, the density-gradient preparations are more suitable.

Mitochondria can also be immuno-isolated, the MitoIP protocol. Laflamme C et al isolated mitochondria from the HEK293 cells transfected with 3xHA-eGFP-OMP25 (Addgene #83356) with anti-HA magnetic beads from Thermo Fisher Scientific (cat# 88837) [25].

Mitochondria have a complex structure comprising the matrix, inner mitochondrial membrane (IMM), intermembrane space and the outer mitochondrial membrane (OMM) which as attached to the inner membrane at "contact sites". Protocols have been published which enable the enrichment and isolation of the various mitochondrial compartments. Isolation of OMM from yeast [26] and rat liver [27] both involve isolation of mitochondria followed by osmotic swelling/shrinking to release the OMM followed by density gradient centrifugation to yield highly purified OMM. Whilst purity is high, OMM yields are typically 1% of total mitochondrial protein. The detachment of the OMM releases the proteins of the intermembrane space. The ‘mitoplasts’ devoid of OMM are a source of enriched IMM. Lysis of the mitoplasts releases the proteins of the mitochondrial matrix.

Methods have also been published for the isolation of mitochondrial-associated membranes (MAM) which connect mitochondria and the endoplasmic reticulum and play an important role in phospholipid metabolism [28-30].

Smith et al [31] used a postnuclear supernatant obtained by a 2,000 g centrifugation, which was then re-centrifuged at 20,000 g for 30 min. The pellet, which contained peroxisomes and mitochondria, was resuspended in MS buffer (0.65 M sorbitol, 5 mM MES, pH 5.5) and was placed on top of a gradient of Nycodenz (17%, 25%, 35%, 50%) in MS buffer. After centrifugation at 116,000 g for 2h, peroxisomes are present in fractions 2 to 8.

Further separation of the peroxisomal membrane-associated proteins was achieved by the Fujiki (1982) and Nuttley et al 1990 method, as cited in [31]. The pellet from the aforementioned 20,000 g centrifugation was resuspended in 10 volumes of Ti8 buffer (Tris 10mM, pH 8.0 and PINS (1 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 2 μg leupeptin/ml, 2 μg aprotinin/ml, and 0.4 μg pepstatin A/ml)) and separated at 200,000 g for 1 h. The pellet, with the peroxisomal membranes, was resuspended again in Ti8 buffer and by addition of 0.1 M sodium carbonate and subsequent centrifugation at 200,000 g for 1 h, the peroxisomal membranes were separated from the proteins which were associated with but not integral to the membranes.

Lysosomes, mitochondria and peroxisomes have very similar densities in sucrose gradients therefore it is preferred to avoid this method. In Percoll, they are denser and such method results in lysosomes with little or no contamination by other organelles.

Washed cells are homogenized with 5 passes in a homogenizer in a 3 mL buffer containing 0.25 M sucrose. An 800 g centrifugation for 10 min will pellet the intact nuclei and debris and the supernatant is stored on ice. The nuclear pellet is resuspended in 0.5 mL of the same buffer, re-centrifuged as before and the supernatant is pooled with the supernatant of the first centrifugation. In this solution, Percoll stock solution (containing 0.25% sucrose) and bovine serum albumin (BSA) are added to a final concentration of 20% (Note: this can be increased to 27%-35%) and 0.4%, respectively (final volume 4.5 mL), and centrifuged at 36,000 g for 30 min (Note: this can vary from 15,000 g for 60 min to 62,500 g for 40 min). The gradient is collected with a gradient unloader in 0.4 mL fractions and the lysosomes are usually close to the bottom of the gradient. To better solubilize the lysosomes and increase recovery, NP-40 is added to a final concentration of 0.5%, before being centrifuged at 100,000 g for 1-2 h. But if intact organelles are of interest e.g., for metabolic assays, NP-40 should be avoided [32].

Lysosomes can be immuno-isolated with the LysoIP protocol. Commercial kits for lysosome enrichment are available. Yoon I et al obtained HEK293T cell lysosomes with Lysosome enrichment kit from Thermo Fisher Scientific using discontinuous Optiprep density gradient centrifugation for Western blotting [33] so did MC Silva et al with differentiated neurons [34]. Laflamme C et al isolated lysosomes from HEK-293 cells transfected with Tmem192-3xHA (Addgene #102930) with anti-HA magnetic beads from Thermo Fisher Scientific (cat# 88837) [25].

Kushimoto et al and Basrur et al used a discontinuous gradient of sucrose in HEPES buffer [35, 36]. More specifically, the cell lysate was resuspended in 2 M sucrose and layered on top of a discontinuous sucrose gradient (1.0, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0 M). After centrifugation at 100,000 g for 1 h, the early stage melanosomes (stage I and II) were recovered in the zone of about 1.0-1.2 M sucrose. This enriched fraction was further separated into tyrosinase-rich and protein-rich fractions by Free-Flow Electrophoresis (FFE) on an Octopus-PZE FFE apparatus at 2.0 ml/hr. FFE was performed at 1000–1100 V and ≈110–125 mA by using 0.25 M sucrose in triethanolamine, pH 7.4, with an elution flow rate of 3–4 ml/min [36]. This procedure gave highly enriched melanosomal samples for proteomics analyses which identified >60 melanosomal proteins [35].

Another protocol which results in melanosomal fractions with high purity was developed by the same researchers. The cell lysate in 2 M sucrose was layered at the bottom of the discontinuous sucrose gradient. After centrifugation at 100,000 g for 1 h, the early stage melanosomes, which were recovered in the zone of about 1 M sucrose was then layered in the middle of an extended gradient of 0.8, 1.0, and 1.2 M sucrose and centrifuged again as before. This additional step completely removed mitochondria "contamination".

The late melanosomes (stage III and IV) were also recovered from the 1.8 M sucrose layer, as they contained a larger amount of melanin and thus were heavier.

Histones are the most basic proteins in the intracellular environment. This is the main characteristic used to enrich histones from cells or Xenopus laevis extracts. Resuspending intact, purified nuclei (as discussed previously) in 0.2 M HCl [37], or sulfuric acid (H2وبالتالي4), and after incubation by rotation at 4°C, most cellular proteins precipitate while histones remain soluble and are recovered by centrifugation at 16,000 g for 15 min [38]. Details may vary. Alternatively, chromatinized histones can be extracted by incubation in 2.5 M NaCl.

A method for Golgi membranes isolation was used by Chen et al [39]. A liver tissue homogenate prepared in buffer containing 0.5 M sucrose was layered on top of 0.86 M sucrose and this was topped off with 0.25 M sucrose. After centrifugation at 103,800 g for 60 min, the membranes were collected at the 0.5-1.3 M interface and adjusted to 0.5 M sucrose.

Centrosomes can be isolated by attached epithelial cultured cells, but still not in great quantities. Andersen et al used more than 2 billion cells (2x10 9 ) [40]. Nuclei are isolated by hypotonic lysis and the centrosomes are harvested after two centrifugation steps. First, by centrifugation onto 50% sucrose cushion and subsequently by centrifugation onto a 40%,50% and 70% sucrose gradient.

Moritz et al have isolated centrosomes from Drosophila embryos as follows: a homogenate (in BRB80 buffer+100mM KCl and 14% sucrose) from 3.5h embryos was centrifuged at 1,500 g for 10 min and the lipids were removed. The supernatant was used to isolate centrosomes after addition of 0.1-0.5% Triton X-100 and 50% sucrose (final concentrations), by loading onto a sucrose gradient (4 mL of 55% and 3 mL of 70%) and centrifuging at 100,000 g for 90 min. Most centrosomes accumulated on top of the 70% cushion [41].

Migrating cells form an extension on one side, which will attach to a new site and subsequently pull the rest of the cell body to the new site. This extension is called pseudopodium. Klemke and colleagues [42] have developed a method to isolate the pseudopodium from the cell body in response to a chemotactic agent. This is achieved by using Transwell migration chambers in 6- or 24-well plates. Briefly, cells are left to attach on the upper side of the filter which has small pores of 3 microns. They are small enough so that the entire cells cannot pass. But the formed pseudopodia can pass and they will attach on the lower side of the filter, when the cells sense the chemotactic agent which has been placed in the lower compartment. Then, cells are fixed and the pseudopodia or the cell bodies can be collected by lysis in the buffer of choice [43].

Song et al have performed subcellular fractionation from mouse livers but this method could be used for other tissues, too, after some modifications [3]. A schema in Figure 3 summarizes the entire procedure. Briefly, the liver homogenate was centrifuged at 1,000 g for 10 min to separate the pellet (P1) and a soluble fraction (S1).

P1 suspended in a final buffer containing 1.8 M sucrose (for complete buffer recipes, the reader is directed to the original publications) was centrifuged at 70,900 g for 90 min and gave a pellet (P2) with the nuclei of liver cells, which can be stored, and a soluble fraction between the 0.25-1.8 M interface (S2). S2 was resuspended in 0.25 M sucrose, centrifuged at 1,200 g for 10 min., and the pellet containing the crude plasma membrane was further suspended in a final buffer containing 1.45 M sucrose and centrifuged at 68,400 g for 60 min. The soluble fraction between the 0.25-1.45 M sucrose was supplemented with a buffer containing 0.25 M sucrose and re-centrifuged at 17,600 g for 10 min. The pellet was resuspended in a final buffer containing 1.35 M sucrose and centrifuged at 230,000 g for 60 min. The 0.25-1.35 M fraction was recovered, diluted with 0.25 M sucrose and re-centrifuged at 40,000 g. The subsequent pellet contained the purified plasma membrane proteins and was stored.

The soluble fraction S1, was re-centrifuged at 8,000 g for 15 min. This afforded an insoluble fraction (P5) which contained crude mitochondria and a soluble fraction (S5) containing ER (light and heavy microsomes) as well as Golgi complex.

After washing, P5 was resuspended in a 12 mL solution containing 25% Nycodenz [44] and layered on a discontinuous Nycodenz gradient (5 mL of 34% and 8 mL of 30%) and topped-off with 8 mL of 23% and 3 mL of 20%. After centrifugation at 52,000 g for 90 min, mitochondria were recovered at the 25-30% interface. This fraction was collected and diluted in a final buffer which resulted in 200 mM mannitol and 50 mM sucrose before being centrifuged at 15,000 g for 20 min. The resulting pellet containing pure mitochondria was washed and stored.

Soluble fraction S5 was centrifuged at 34,000 g for 30 min and resulted in a pellet (P6), and a soluble fraction with the light microsomes (S4). S4 was centrifuged at 124,000 g to separate the cytosol, which was stored, from the microsomes (pellet). P6 was mixed with the light microsomes from the previous centrifugation and diluted in a final buffer containing 0.25 M sucrose and 0.015 M CsCl. The solution was laid on a 1.3 M sucrose solution and centrifuged at 237,000 g for 2 h. This separated the rough ER (pellet) from the smooth ER at the 0.25-1.3 M interface. This soluble fraction was diluted 1:1 with 0.25 M sucrose and centrifuged at 124,000 g for 60 min. The smooth ER was recovered in the pellet and stored [3].

Neuronal nuclei can also be further isolated through fluorescence-activated nuclear sorting (FANS), during which the isolated nuclei are fixed with paraformaldehyde (or ethanol), labeled with an anti-NeuN antibody or another nuclear antibody with or without an appropriate secondary antibody and counterstained with propidium iodide or DAPI in a solution containing RNase A and chicken erythrocyte nuclei [45, 46], or with variations for, for example, single-nucleus RNA-seq [47], ChIP-seq, PLAC-seq or ATAC-seq [48]. Electronically gated diploid neuronal nuclei are then determined by PI/DAPI fluorescence and immunolabeling through flow cytometry [45, 46].

Stress granules (SG), considered a type of biomolecular condensates [49], are RNA-protein complexes, which are generated in response to the effects of various exogenous stressors [50], through liquid-liquid phase transition. Each mammalian SG contains an external active phase, which dynamically interacts with encircling cytoplasm, and an RNA-protein core with high stability [51]. In comparison to mammalian stress structures, yeast SGs mainly consist of large RNA-protein cores with significantly smaller external shells.

The standard SG isolation is based on consecutive centrifugation to concentrate SG cores and immunoprecipitation to purify the obtained SGs. There are several techniques to generate SGs [52]. Separate protocols have been established for the isolation of RNA-protein SG cores from mammalian and yeast SGs [51]. Following the induction of SGc, the cells are usually lysed by several passages via a 25G 5/8 needle on ice. For the enrichment of SG scores, the cellular lysates are centrifuged at 18,000 x g for 20 min at 4oC. The purification of SGs may be achieved by either antibodies to SG structures directly or antibodies to tagged SG particles. Microscopic analysis, mass spectrometry-based exploration of protein structure and evaluation of proteins using SDS-PAGE gel are usually suggested for estimation of the efficient SG isolation. Potential problems with the isolation of SG cores include low yield of SGs or detection of SG scores in intact control samples. Low yield might be corrected by increasing initial sample volume or optimization of the antibodies for immunoprecipitation. It is recommended to wash the control cells in a cell medium rather than PBS to avoid detecting SGs in unstressed cells.

A new method of SG preparation for RNA-seq has recently been developed [53, 54]. The RNA isolation for RNA-seq is performed by the TRIZOL-based method. RNA-Seq results would be confirmed by the FISH method. Briefly, the stressed cells are fixed, stained with FISH probes and subjected to imaging using either widefield fluorescence or confocal microscopy.

In recent years, several kits for subcellular fractionation of cells, obtained both from culture and from tissues, have become commercially available. These commercial kits are, in general, aimed at the rapid isolation of fractions from relatively small quantities of cell / tissues (often 100–200 mg of cells/tissue) in a short period of time (less than 2 hours) and many of the kits require only a bench top centrifuge. Kits from different manufacturers allow for different degrees of fractionation. Some allow fractionation into cytoplasmic, plasma membrane, nuclear chromatin and cytoskeletal fractions whilst others offer a more basic fractionation into cytoplasmic, mitochondrial and nuclear fractions. Kits also exist specifically for the isolation of mitochondria from cells and tissues. For example, M Oginuma et al separated nuclear and cytoplasmic fractions from human iPS cells with the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction kit (78833) from Thermo Fisher Scientific [55]. M Pradas-Juni et al obtained cytoplasmic and nuclear fractions from freshly isolated primary hepatocytes using Nuclei Isolation Kits: Nuclei EZ Prep from MilliporeSigma [56]. Virk HS et al prepared membrane and cytosolic lysates for western blot using Mem-PER Plus Protein Extraction Kit from Thermo Fisher Scientific [57]. Liu Y et al obtained nuclear separation through the nuclear extraction kit from EpiGentek [58]. Wang L et al prepared nuclear extracts from RAW264.7 cells with the Nuclear Complex Co-IP Kit (54001) from Active Motif for incubation with HSV-1 genomic DNA [59]. Lee YR et al separated membrane fractions of 293T, MEF, or PC3 cells for cytosolic fractions with ProteoExtract Native Membrane Protein Extraction Kit from Calbiochem to investigate the membrane recruitment of PTEM [60]. Saito T et al prepared nuclear and cytoplasmic fractions from livers and cultured cells with the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents from Thermo Fisher for Western blotting [61].

For many uses the commercial kits may be an excellent approach, especially for non-specialist laboratories. However, there are potential drawbacks. The isolation buffers often contain detergents which may interfere with protein function. Furthermore, the often proprietary nature of the buffers makes it difficult for the more experienced researcher to fine tune the isolation depending on the precise cell source and/or end use of the isolated fractions.

Some of subcellular fractions are directly available from commercial suppliers, for example, microsomes from Sekisui XenoTech [62].

If large quantities of a particular organelle or subcellular membrane are required, it may be necessary it is generally impractical to use methods involving density gradient centrifugation steps. In such cases the protocol depicted in Figure 3 can be replaced by one based solely on differential centrifugation. low-speed centrifugation (500 g for 10 min) yields a crude nuclear fraction, medium speed centrifugation (10 000 g for 20 min) yields a crude mitochondrial/peroxisomal fraction, and a final ultracentrifugation step (100 000 g for 60 min) yields a crude microsomal fraction) [63]. As with all such protocols, variations exist [64].

Methods have been published for the large scale isolation of enriched plasma membranes from both plant and mammalian microsomal fractions using an aqueous 2-phase system [65, 66]. Partition in a 2-phase Dextran/PEG system is capable of producing plasma membrane preparations of 85–90 % purity in yields of up to 20%.

A quick review of the literature reveals a seemingly bewildering array of different protocols for subcellular fractionation. However, on closer inspection most are variations on long-established protocols protocols are often fine-tuned for different cell and tissue types.

  • What organelle(s)/cell compartments(s) do I wish to study? One or many?
  • What do I want to use the isolated organelles/compartments for? For example, proteomics/lipidomics or functional studies?
  • How much material do I need? Small amounts for MS analysis or substantial quantities for detailed functional studies?
  • How pure do the organelles/compartments need to be? For quantitative proteomic analysis, the purity of each fraction may be of paramount importance. For functional studies it may often be sufficient to use a relative crude enriched fraction rather than one that is highly purified.

The answers to these questions will help the researcher to decide upon the best subcellular fractionation protocol for their particular needs.

Suspend the plant tissue homogenate in an isotonic medium (0.35 mol/L sodium chloride or 0.4 mol/L sucrose solution) to minimize any damage to the chloroplasts. Centrifuge the homogenate at 1000 rpm for 2 min to remove tissue residues and remaining cells. Then centrifuge at 3000 rpm for 5 min to obtain the chloroplast pellets. Centrifugation should be done at 0

نعم فعلا. Centrifugal force does not damage the mitochondrial structure. Besides, the centrifugal buffer has a protective role for mitochondria.


شاهد الفيديو: علم الاحياء الجزيئي المحاضرة الاولىIntroduction to molecular biology الجزء1 (كانون الثاني 2022).