معلومة

كيف يمكن أن ينتج عن تكرار الحمض النووي تراكيب دبوس الشعر؟


قال أستاذي إن أحد أسباب أهمية بروتينات SSB هو منع تكوين هياكل دبوس الشعر ، ولا أستطيع أن أرى كيف أو لماذا سيشكل الحمض النووي هياكل دبوس الشعر وليس هناك الكثير عنها على الإنترنت ، لذا يمكن لأي شخص شرح ذلك شيء دبوس الشعر وكيف تمنع بروتينات SSB حدوثه؟


تتشكل دبابيس شعر الحمض النووي عندما تكون منطقتان في نفس الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل مكملة في تسلسل النوكليوتيدات ولكن في اتجاهين متعاكسين (كما هو موضح في الصورة أدناه). هاتان المجموعتان من متواليات النوكليوتيدات تتسلسل زوجًا أساسيًا مع بعضها البعض عن طريق تكوين روابط هيدروجينية بين الأدينين - الثايمين والجوانين - السيتوزين على التوالي لتشكيل حلقة دبوس الشعر. يمكن رؤية نفس الهياكل في حالة الحمض النووي الريبي.

(الشكل عبر: https://brilliant.org/problems/dna-zipper/)

ترتبط بروتينات الارتباط المفرد (SSB) بتسلسل نوكليوتيد الحمض النووي الفردي وتمنع انهيار الحمض النووي المركب حديثًا بسبب النيوكليزات ، كما أنها تزيل البنية الثانوية لخيوط الحمض النووي مثل حلقات دبوس الشعر بحيث يمكن للأنزيمات الأخرى الارتباط بشريط الحمض النووي والعمل بشكل صحيح . كما هو موضح في الشكل أدناه ، يرتبط SSB بـ ssDNA من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية ويمنع تكوين الرابطة داخل النيوكليوتيدات في خيط DNA الفردي ، وبالتالي منع تكوين حلقات دبوس الشعر في DNA.

(الشكل عبر: http://helicase.pbworks.com/w/page/17605582/Amanda-Kinney)

(عبر: https://proteopedia.org/wiki/index.php/Single_stranded_binding_protein)


إذا كان لديك امتداد من الحمض النووي أحادي السلسلة يكون متناوبًا ، فإن تلك المنطقة المتناوبة يمكن أن تشكل روابط هيدروجينية لنفسها ، وتشكل دبوس شعر. ترتبط بروتينات SSB المرتبطة بـ ssDNA وتتحرك على طولها فعليًا في طريق طي دبوس الشعر وتفككه.


رسم خرائط مكامن الخلل في الحمض النووي

يدرس الباحثون تغيرات الحمض النووي في الخميرة. الائتمان: ألونسو نيكولز

إليك تحديًا لك: انسخ مستندًا طوله 1200000 صفحة حرفًا بحرف وحرفًا بكلمة - وهذا عبارة عن كومة من الورق أعلى من تمثال الحرية. ولا تقم بأي أخطاء إملائية أو تفوت أي علامات ترقيم.

هل أنت على مستوى هذه المهمة؟ نعم ، أنت كذلك: لقد كان جسمك يؤدي هذه المهمة تريليونات المرات منذ أن تم تصورك ، وأنت تقوم بها الآن. ما نتحدث عنه ، بالطبع ، هو تكرار الجينوم البشري - أي حوالي 25000 جين مشفر للبروتين وحده في كل مرة تنقسم فيها الخلية.

تمتلك الخلايا في أجسامنا آليات معقدة لضمان نسخ رمز حياتنا بأمانة لعدد فلكي من المرات. إن الإنزيمات المصممة خصيصًا لقراءة وكتابة ونسخ الأزواج الأساسية من الجوانين والسيتوزين والأدينين والثايمين - التي تشكل الحلزون المزدوج للحمض النووي - تعمل بوتيرة سريعة لضمان عدم حدوث أخطاء أثناء النسخ المتماثل.

على الرغم من أن الأخطاء تحدث عادةً مرة واحدة كل مليار "حرف" - G و C و A و T - إلا أن هذا لا يكفي عادةً للتسبب في مشكلة ، وأحيانًا يكون ضروريًا للسماح بتكيف الأنواع مع البيئات المتغيرة.

ومع ذلك ، يمكن أن تحدث مشكلة خطيرة عندما تعترض هياكل الحمض النووي غير الطبيعية طريق الإنزيمات التي تنسخ الحمض النووي ، مما يخلق حواجز على الطريق. هذه الحواجز هي نقاط توقف هشة في التسلسل ، مما يؤدي إلى القابلية للإصابة بالسرطان وأمراض أخرى.

في ربيع هذا العام ، حددت أستاذة جامعة تافتس ورئيسة علم الأحياء كاثرين فرويدنريتش وزملاؤها الخصائص المميزة لهياكل الحمض النووي غير الطبيعية هذه ولماذا تؤدي إلى هشاشة الجينوم. في حين أن المناطق الهشة من الحمض النووي معروفة لبعض الوقت ، فإن هذه الدراسة تمثل أول نظرة على الآلية الجزيئية التي تسبب الهشاشة.

الحمض النووي الطبيعي ، وأولئك الذين لديهم أشكال صليبية ودبابيس شعر. الائتمان: كاثرين فرويدنريتش

قال فرويدنريتش: "حتى الآن ، تم تحديد ما يقرب من ثمانين موقعًا هشًا شائعًا في الحمض النووي البشري". "هذه المناطق من الحمض النووي موجودة في جميع البشر وهي مستقرة بشكل طبيعي ، ولكن يمكن أن تنكسر إذا تم الضغط على الخلايا أثناء محاولة نسخ مادتها الجينية."

غالبًا ما يكون كسر الكروموسوم حدثًا مبكرًا في تطور الورم. Freudenreich و Simran Kaushal AG18 ، المؤلف الأول للدراسة التي ظهرت في تقارير الخلية، فحص أحد تلك المواقع الهشة ، يسمى FRA16D ، لفهم أسباب هشاشته وكيف يضع مفتاح ربط في آلية الإصلاح العادية. لتسهيل الدراسة ، نظروا في تسلسلات الحمض النووي المماثلة في الخميرة بدلاً من البشر.

اتضح أن منطقة من الموقع الهش تحتوي على سلسلة من قواعد الأدينين والثايمين تتكرر عدة مرات ، أتاتات - وهكذا. عندما يكون هناك ما يقرب من عشرين أو أكثر من هذه التكرارات ، يمكن للحمض النووي أن يتشابك فيه ، مما يؤدي إلى تكوين هيكل صليبي أو دبوس شعر. يمكن أن يتسبب ذلك في خروج آلية استنساخ الحمض النووي عن مسارها ، مثل قطار يطير عن مسار ملتوي.

اكتشف كوشال أن طاقم إصلاح الإنزيم وصل يحتوي على عدة نوكلياز ، بما في ذلك واحد يسمى Mus81 ، والذي يقطع الأجزاء المنحنية من المسار. تنهي الإنزيمات الأخرى الإصلاح ، لكن منعطف الشعر يسارًا بواسطة Mus81 يمكن أن يجعل من الصعب القيام بالمهمة بشكل صحيح تمامًا. توجد الإنزيمات لإصلاح دبابيس الشعر ، ولكن عندما تكون الخلية متوترة ، فإنها لا تستطيع مواكبة - وتتراكم الأخطاء.

قال فرويدنريتش: "قد تفسر هذه النتيجة سبب تعرض المواقع الهشة الشائعة لتراكم عمليات الحذف في الخلايا السرطانية". "لا ينكسرون أكثر فحسب ، ولكن بمجرد كسرهم ، يثبطون عملية الإصلاح ، مما يؤدي إلى فقدان تسلسل الحمض النووي ، أو تفتت الكروموسوم. هذه فكرة جديدة ستؤثر بشكل كبير على المنظور في هذا المجال."

قال كوشال: "إن تحديد الإنزيمات - بالإضافة إلى Mus81 - المسؤولة عن الأخطاء في إصلاح الحمض النووي يعني أنه يمكننا التعامل بشكل أفضل مع الوسائل الممكنة للوقاية من السرطان".


إعادة النظر

لقد غمرتنا مشاريع تسلسل الجينوم بالمعلومات المتعلقة بالأساس الجيني للحياة. بينما توفر هذه الثروة من المعلومات أساسًا لفهمنا لعلم الأحياء ، فقد أصبح من الواضح أن شفرة الحمض النووي وحدها لا تحتوي على جميع الإجابات. تساهم التعديلات الوراثية اللاجينية وتركيبات الحمض النووي ذات الترتيب الأعلى خارج الحلزون المزدوج أيضًا في العمليات البيولوجية الأساسية والحفاظ على الاستقرار الخلوي. من المعروف أن هياكل DNA البديلة المحلية موجودة في جميع أشكال الحياة [1]. يمكن أن يؤدي الالتفاف الفائق السلبي للحمض النووي إلى إحداث تغييرات توافقية تعتمد على تسلسل النوكليوتيدات المحلية والتي تؤدي إلى ظهور أشكال صليبية ودنا أعسر وثلاثي وثلاثيات ثنائيات رباعية [2-4]. يعتمد تكوين الأشكال الصليبية بشدة على التسلسل الأساسي ويتطلب تكرارات مقلوبة كاملة أو ناقصة لـ 6 نيوكليوتيدات أو أكثر في تسلسل الحمض النووي [5 ، 6]. تمت ملاحظة التمثيل الزائد للتكرارات المقلوبة ، والتي تحدث بشكل غير عشوائي في الحمض النووي لجميع الكائنات الحية ، بالقرب من تقاطعات نقاط التوقف ، ومناطق المحفز ، وفي مواقع بدء النسخ المتماثل [3 ، 7 ، 8]. قد تؤثر الهياكل الصليبية على درجة الالتفاف الفائق للحمض النووي ، وموضع النيوكليوسومات في الجسم الحي[9] ، وتكوين البنى الثانوية الأخرى للحمض النووي. تحتوي الأشكال الصليبية على عدد من العناصر الهيكلية التي تعمل كأهداف مباشرة للبروتينات والحمض النووي. لقد ثبت أن العديد من البروتينات تتفاعل مع الأشكال الصليبية ، وتتعرف على ميزات مثل تقاطعات الحمض النووي ، والتقاطعات رباعية الاتجاهات ، والحمض النووي المنحني أو المنحني. تحدث التحولات الهيكلية في الكروماتين بالتزامن مع نسخ أو نسخ الحمض النووي وفي العمليات التي تنطوي على فصل موضعي لخيوط الحمض النووي. يُعتقد أن مثل هذه التحولات تسهل تكوين هياكل بديلة للحمض النووي [10 ، 11]. تتشكل لفائف عظمى عابرة في جينوم حقيقيات النوى أثناء تكرار ونسخ الحمض النووي ، وغالبًا ما تتضمن هذه الملفات ارتباطًا بالبروتين [12]. في الواقع ، تعد إعادة تشكيل الكروماتين النشط ميزة نموذجية للعديد من المحفزات وهي ضرورية لنسخ الجينات [13]. والجدير بالذكر أن الالتفاف الفائق للحمض النووي يمكن أن يكون له تأثير قوي على التعبير الجيني [14]. باستخدام المصفوفات الدقيقة التي تغطي بكتريا قولونية الجينوم ، فقد تبين مؤخرًا أن التعبير عن 7٪ من الجينات يتأثر بشكل سريع وملحوظ بفقدان الالتفاف الصبغي الفائق [15]. العديد من المجمعات التي تنطوي على تفاعلات بروتينية واسعة النطاق ، حيث يلتف الحمض النووي حول البروتين ، يمكن أن تحدث فقط في ظل ظروف الالتفاف السالب للحمض النووي [10]. تم الإبلاغ عن بروتينات أخرى تتفاعل مع الحمض النووي الفائق الالتفاف (scDNA) عند نقاط العبور أو على أجزاء أطول من الملف الفائق المتشابك [16 ، 17]. ومن المثير للاهتمام ، أن جينوم حقيقيات النوى قد ثبت أنه يحتوي على نسبة مئوية من الملفات الفائقة غير المقيدة ، والتي يمكن أن يُعزى جزء منها إلى تنظيم النسخ [3]. إن التوليد التلقائي للفائق الفائق للحمض النووي هو أيضًا مطلب لتنظيم الجينوم [18]. تتشكل الملفات الفائقة العابرة أمام وخلف شوكات النسخ المتماثل حيث يتم توزيع الإجهاد الفائق في جميع أنحاء جزيء الحمض النووي المتماثل بأكمله [19]. قد يعمل عدد من العمليات الإضافية لإنشاء ضغوط فوق حلزونية عابرة وموضوعية في الحمض النووي حقيقية النواة.

يبدو أن التعرف على الحمض النووي الصليبي مهم ليس فقط لاستقرار الجينوم ، ولكن أيضًا للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية. على هذا النحو ، ليس من المستغرب أن تظهر العديد من البروتينات خصائص ارتباط خاصة بالبنية الصليبية. في هذه المراجعة ، نركز على هذه البروتينات ، التي يشارك الكثير منها في تنظيم الكروماتين ، والنسخ ، والتكرار ، وإصلاح الحمض النووي ، وعمليات أخرى. لتنظيم مراجعتنا ، قمنا بتقسيم بروتينات الربط الصليبية إلى أربع مجموعات (انظر الجدول 1) وفقًا لوظائفها الأساسية: (أ) إنزيمات حل الوصلات ، (ب) عوامل النسخ وبروتينات إصلاح الحمض النووي ، (ج) آلية النسخ المتماثل ، و (د) البروتينات المرتبطة بالكروماتين. لكل مجموعة ، نصف بالتفصيل الأمثلة الحديثة لنتائج البحث. أخيرًا ، نستعرض كيف يرتبط عدم انتظام بروتينات الارتباط الصليبي بعلم أمراض بعض الأمراض الموجودة في البشر.

تشكيل وحضور ج الهياكل الصخرية في الجينوم

الهياكل الصليبية هي منظمات مهمة للعمليات البيولوجية [3 ، 5]. كل من الحلقات الجذعية والصليبية قادرة على التشكيل من التكرارات المقلوبة. تتكون الهياكل الصليبية من نقطة فرع وجذع وحلقة ، حيث يعتمد حجم الحلقة على طول الفجوة بين التكرارات المقلوبة (الشكل 1). تؤدي التكرارات المقلوبة المباشرة إلى تكوين صليبي مع الحد الأدنى من الحلقة المفردة التي تقطعت بها السبل. تشكيل صليبية الشكل من التكرارات المقلوبة غير المباشرة التي تحتوي على فجوات لا يعتمد فقط على طول الفجوة ، ولكن أيضًا على التسلسل في الفجوة. بشكل عام ، تزيد متواليات الثغرات الغنية بـ AT من احتمالية التكوين الصليبي. من الممكن أيضًا أن يشكل تسلسل الفجوة بنية بديلة للحمض النووي. يكون لتشكيل صليبات الحمض النووي تأثيرًا قويًا على هندسة الحمض النووي حيث يمكن تقريب التسلسلات التي تكون عادةً بعيدة عن بعضها البعض [20 ، 21]. تمت دراسة بنية الصلبان بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية [22-24]. حددت هذه الدراسات فئتين متميزتين من الصلبان. فئة واحدة من الصليبيين ، يُشار إليها على أنها غير مطوية ، لها شكل مستو مربع يتميز بتماثل رباعي حيث تكون الأذرع المجاورة متعامدة تقريبًا مع بعضها البعض. تشتمل الفئة الثانية على شكل مطوي (أو مكدس) حيث تشكل الأذرع المجاورة زاوية حادة مع خيوط الحمض النووي الرئيسية (الشكل 2). تم العثور أيضًا على اثنين من الأشكال الهيكلية الثلاثة المتأصلة في الصلبان ، ونقطة التفرع والساق ، في تقاطعات هوليداي. تتشكل تقاطعات Holliday أثناء إعادة التركيب ، وإصلاح الكسر المزدوج ، وانعكاس الشوكة أثناء النسخ المتماثل. حل تقاطعات هوليداي هو عملية حاسمة للحفاظ على الاستقرار الجيني [25 ، 26]. يتم حل هذه التقاطعات بواسطة فئة من نوكليازات البنية المحددة: إنزيمات حل الوصلات.

التغييرات المرتبطة بالانتقال من الحالة الخطية إلى الحالة الصليبية في التسلسل المستهدف p53 من مروج p21. يحتوي تسلسل المحفز على تسلسل مستهدف 20 نقطة أساس p53 مع تكرار مقلوب طويل 7 نقاط أساس (أحمر) ، (أ) كدنا خطي و (ب) كتكرار مقلوب كهيكل صليبي. في الهيكل الصليبي ، يتم تقديم تسلسل الهدف p53 كسيقان وحلقات.

تشابه هيكل صليبي. يمكن أن تختلف التوافقات للصليب الصليبي من (أ) "غير مطوي" مع تناظر رباعي إلى (ب) منحني ، و (ج) "مكدس" بأربع سلاسل من الحمض النووي في الجوار القريب. د) طوبولوجيا تقاطع هوليداي استقرت بواسطة عامل ربط عبر السورالين (PDBID 467D). هنا ، يأخذ التقاطع شكل هيكل x متراكم معادٍ متوازي.

الصليبية ليست مستقرة ديناميكيًا في الحمض النووي الخطي العاري بسبب هجرة الفروع [27]. تشكيل الهيكل الصليبي في الجسم الحي تم عرضه في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى باستخدام العديد من الأساليب المنهجية. تم وصف وجود البنية الصليبية لأول مرة في DNA البلازميد الدائري حيث يمكن للكثافة الفائقة السالبة أن تثبت التكوين الصليبي. عادة ما تحتوي البلازميدات ذات الكثافة الفوقية الأصلية على هياكل صليبية في المختبر و في الجسم الحي[28]. على سبيل المثال ، تم إظهار وجود بنية ذات ترتيب أعلى في بلازميد pT181 في الجسم الحي باستخدام العلاج برومواسيتالدهيد [29]. يؤدي حذف التسلسل الذي يشكل هذه البنية في موقع ori إما إلى تقليل أو فشل النسخ المتماثل [30]. وبالمثل ، يؤدي حذف مجال الارتباط الصليبي في بروتينات 14-3-3 إلى تقليل ارتباط الأصل الذي يؤثر على بدء تكرار الحمض النووي في الخميرة الناشئة [31]. تم أيضًا استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد الهياكل الصليبية بنجاح لعزل المقاطع المحتوية على صليب الشكل من الحمض النووي الجيني. علاوة على ذلك ، كانت هذه التسلسلات قادرة على التكاثر بشكل مستقل عند نقلها إلى خلايا هيلا [32]. أدى تثبيت الهياكل الصليبية بواسطة الأجسام المضادة أحادية النسيلة 2D3 و 4B4 ، مع خصوصية الحمض النووي الصليبي المضاد ، إلى تعزيز التكاثر من 2 إلى 6 أضعاف في الجسم الحي[33]. تم العثور على 14-3-3 سيجما لربط في الجسم الحي مع أصول القرد لتكرار الحمض النووي ors8 و ors12 بطريقة تعتمد على دورة الخلية ، كما تم فحصها بواسطة مقايسة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) الذي يتضمن ارتباطًا متصالبًا بالفورمالديهايد ، متبوعًا بالترسيب المناعي مع الأجسام المضادة لـ 14-3-3 سيجما والكمي PCR [34]. وبالمثل ، فإن متجانسات البروتين 14-3-3 من خميرة الخميرة، Bmh1p و Bmh2p ، لهما نشاط ربط الحمض النووي الصليبي والمرتبط في الجسم الحي مع ARS307 [35]. تظهر العديد من الدراسات أن النسخ يتم تنظيمه مباشرة من خلال وجود بنية صليبية في الجسم الحي. مثال آخر يتضمن قدرة إدراج d (AT) n-d (AT) n على تبني حالة صليبية تلقائيًا في بكتريا قولونية، مما أدى إلى كتلة من تخليق البروتين [36]. باستخدام التحليل الطفري الموجه بالموقع ورسم خرائط نوكلياز P1 ، تم إثبات أن تكوين بنية صليبية الشكل مطلوب لقمع وظيفة المحسن في فحوصات تعداء عابرة وأن عناصر Alu قد تساهم في تنظيم مُحسِّن جين ألفا CD8 من خلال التكوين من البنية الثانوية التي تعطل وظيفة المحسن [37]. اللفائف الفائقة السلبية المدفوعة نسبيًا تتوسط أيضًا تشكيل صليبي الشكل في الجسم الحي والتكوين الصليبي المعزز يرتبط بارتفاع نشاط المحفز [38]. وقد تبين أيضًا أن هياكل الحمض النووي الثانوية لعنصر ATF / CREB تلعب دورًا حيويًا في تفاعلات البروتين والحمض النووي وأن عوامل النسخ المرتبطة به تلعب دورًا رئيسيًا في نشاط المروج لجين RNMTL1 [39]. يُظهر نقص الميثيل للتكرارات المقلوبة بواسطة ميثيلاز السد أن هذه التسلسلات متوافقة مع بنية ثانوية غير عادية ، مثل صليب الحمض النووي أو دبوس الشعر في الجسم الحي[40]. ال في الجسم الحي تمت دراسة تأثيرات التكوين الصليبي أثناء النسخ بالتفصيل بواسطة Krasilnikov et al. [4]. من المثير للاهتمام أن الحمض النووي الخطي المغطى بقص الشعر (والذي يلعب فيه تكرار الحمض النووي المغطى بقص الشعر والتشكيل الصليبي والدقة أدوارًا مركزية) تم الحفاظ عليه بثبات لأشهر في خط الخلايا السرطانية البشرية مثل العديد من حلقات الكروموسومات الإضافية [41]. يمكن أيضًا أن تؤدي المتناظرات الطويلة إلى حدوث فواصل في الحمض النووي بعد افتراض بنية صليبية. Palindromes في S. cerevisiae تم حلها ، في الجسم الحي، بواسطة الإنزيمات الخاصة بالهيكل. يتطلب القرار في الجسم الحي إما نوكلياز Mus81 أو ، كبديل ، البكتيرية HJ resolvase RusA. توفر هذه النتائج تأكيدًا على البثق الصليبي الشكل والقرار في سياق الكروماتين حقيقي النواة [42]. مجتمعة ، تظهر هذه الدراسات أنه تم اكتشاف صليب في الجسم الحي باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المستقلة وأنها ظاهرة مثيرة للاهتمام ومتكاملة لبيولوجيا الحمض النووي والكيمياء الحيوية.

تشارك البروتينات في التفاعلات مع الهياكل الصليبية

إنزيمات مذيبة للتقاطع

يوجد عدد كبير من البروتينات التي تتعرف على الأشكال الصليبية (ملخصة في الجدول 1) ، ومن بينها ، تمت دراسة إنزيمات حل الوصلات على نطاق واسع. تم التعرف على هذه البروتينات في العديد من الكائنات الحية من البكتيريا (والعاقمات الخاصة بهم) إلى الخميرة والأرشيا والثدييات [43]. يمكن تقسيم غالبية الإنزيمات المحللة للوصلات إلى واحدة من عائلتين كبيرتين [44]. يستهدف أولئك الموجودون في الدرجة الأولى تسلسلات محددة من الحمض النووي للنشاط الإنزيمي ، على الرغم من أنهم سيرتبطون جيدًا بنفس القدر بتقاطعات أي تسلسل. تشتمل هذه العائلة الفائقة على E. coli RuvC ، وتكامل الخميرة ، و Cce1 ، و Ydc2 ، و RnaseH. تشتمل المجموعة الثانية على Phage T7 ، و endonuclease RecU ، وإنزيمات Hjc و Hje المُحللة ، وعائلة بروتين MutH وإنزيمات التقييد ذات الصلة. تبرز هياكل الأشعة السينية للأنزيمات التي تحل الوصلات المعقدة ذات الوصلات الرباعية المرونة الكامنة في الحمض النووي (الشكل 3) [25] حيث تتعرف هذه الإنزيمات على الوصلة وتشوهها. وهذا يمكنهم من القيام بأدوار رئيسية مثل انشقاق الدنا الخيفي والحفاظ على الاستقرار الجيني على سبيل المثال لا الحصر. كان التعرف على التركيب غير B-DNA عن طريق إنزيمات حل الوصلات موضوعًا للعديد من المراجعات [25 ، 43 ، 45 ، 46].

التركيب البلوري لرباعي E. coli RuvA في مركب مع تقاطع Holliday (PDBID 1C7Y). أ) يتم الضغط على مفترق Holliday في المركز حيث تجري اتصالات وثيقة مع RuvA. يأخذ كل ذراع خارج مركز الوصلة شكلًا قياسيًا من الحمض النووي بيتا ب) دوران أ) بمقدار 90 درجة.

البروتينات المشاركة في النسخ وإصلاح الحمض النووي

يتم الحفاظ على الاستقرار الجيني للخلية من خلال عدة آليات مستقلة. يمكن القول إن أهم هذه الآليات هو إصلاح الحمض النووي. وبالتالي فإن ارتباط البروتين بالحمض النووي التالف وببنى الحمض النووي البديل المحلي هو وظيفة رئيسية لهذه العمليات. غالبًا ما تتميز مناطق المحفز للجينات بوجود تكرارات مقلوبة قادرة على تكوين صليبات في الجسم الحي. عدد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي ، مثل تلك الموجودة في عائلة HMGB-box [47] ، Rad54 [48] ، بروتين BRCA1 [49 ، 50] ، بالإضافة إلى PARP-1 (بولي (ADP-ribose) polymerase-1 ) [51] ، يعرض فقط تفضيل تسلسل ضعيف ولكن يرتبط بشكل تفضيلي بالبنى الصليبية. علاوة على ذلك ، يمكن لبعض البروتينات أن تحث على تكوين هياكل صليبية عند ارتباط الحمض النووي [51 ، 52]. من بين بروتينات إصلاح الحمض النووي التي ترتبط بالصلبان إنزيمات حل الوصلات Ruv و RuvB [53 ، 54] ، DNA هيليازات [55] ، بروتين XPG [56] ، والبروتينات متعددة الوظائف مثل بروتينات HMG-box [57] BRCA1 ، 14 -3-3 عائلة بروتينية بما في ذلك homolog's Bmh1 و Bmh2 من S. cerevisiae، و GF14 من النباتات. أشار تحليل البصمة لمنطقة المروج الجيني للهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية إلى أن مستقبل هرمون الاستروجين البشري (ER) هو بروتين ربط صليبي محتمل آخر. في هذه الحالة ، أتاح قذف الهيكل الصليبي الوصول إلى عناصر استجابة الإستروجين بواسطة بروتين ER [58].

PARP-1

PARP-1 هو بروتين وفير ونووي وبروتين إصبع الزنك موجود في

1 إنزيم لكل 50 نواة. إنه ذو صلة عالية بالحمض النووي التالف ويصبح نشطًا بشكل تحفيزي عند الارتباط بفواصل الحمض النووي [59]. في حالة عدم وجود تلف في الحمض النووي ، يؤدي وجود PARP-1 إلى اضطراب اتصالات الحمض النووي بالهيستون مما يسمح بالوصول إلى الحمض النووي للعوامل التنظيمية [60]. يرتبط نشاط PARP-1 أيضًا بتنسيق بنية الكروماتين والتعبير الجيني في ذبابة الفاكهة [61]. تم الإبلاغ عن أن PARP يمكن أن ترتبط بدبابيس شعر DNA في DNA heteroduplex وأن التعديل التلقائي لـ PARP في وجود NAD + يثبط نشاط ربط دبوس الشعر. كشفت دراسات مجهر القوة الذرية أن ، في المختبر، بروتين PARP له تفضيل للمنطقة المحفز لجين PARP في الحمض النووي الفائق حيث تشكل عناصر تناظر الصبغ دبابيس الشعر (الشكل 4) [62]. يتعرف PARP-1 على التشوهات في العمود الفقري للحمض النووي مما يسمح له بالارتباط بوصلات ثلاثية وأربعة اتجاهات [63]. أظهر التحليل الحركي أن السمات الهيكلية للحمض النووي غير B مهمة لتحفيز PARP-1 الذي يتم تنشيطه بواسطة الحمض النووي غير التالف. لقد تبين أن ترتيب تفضيل الركيزة لـ PARP-1 هو: الحلقات الصليبية & gt loops & gt linear DNA. تشير هذه النتائج إلى وجود صلة بين ارتباط PARP-1 بهياكل الأشكال الصليبية في الجينوم ووظيفتها في تعديل بنية الكروماتين في العمليات الخلوية. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن ارتباط PARP-1 بالحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في طوبولوجيا الحمض النووي كما تم توضيحه باستخدام أهداف DNA البلازميد [51].

صور AFM و SFM للبروتينات المرتبطة ببنية صليبية. أ) صور AFM لربط PARP-1 ببلازميد pUC8F14 فائق الالتصاق يحتوي على تكرار مقلوب 106 نقطة أساس. يرتبط PARP-1 بنهاية ذراع دبوس الشعر (السهم الأبيض). تظهر الصور مساحة سطح 300 × 300 نانومتر 2 (أعيد طبعها بإذن من [51]. ب) التفاعل بين p53CD والحمض النووي فائق الالتفاف يؤدي إلى تكوين هياكل صليبية. تظهر صورة SFM للمركب المتكون بين p53CD و sc pXG (AT)34 تم تركيب DNA البلازميد بنسبة مولارية 2.5 معقدات في وجود 10 ملي مولار مجأك2. تمثل أشرطة مقياس 200 نانومتر (أعيد طبعها بإذن من [132].

يمكن القول إن P53 هو أحد أكثر الجينات المثبطة للورم التي تمت دراستها بشكل مكثف. تحتوي أكثر من 50٪ من جميع الأورام البشرية على طفرات p53 ويلعب تعطيل هذا الجين دورًا حاسمًا في تحريض التحول الخبيث [64]. يعد ارتباط الحمض النووي الخاص بالتسلسل أمرًا بالغ الأهمية لوظيفة p53. متواليات الهدف P53 ، والتي تتكون من نسختين من التسلسل 5'-RRRC (A / T) (T / A) GYYY-3 ، غالبًا ما تشكل تكرارات مقلوبة [65]. تم الإبلاغ عن أن ارتباط p53 حساس لدرجة الحرارة ويعتمد على طول جزء الحمض النووي [66 ، 67]. علاوة على ذلك ، تم إثبات ذلك ، في الجسم الحي، فإن ارتباط p53 بتسلسله المستهدف يعتمد بشكل كبير على وجود تكرار معكوس في الموقع المستهدف. تم أيضًا وصف الارتباط التفضيلي لـ p53 مع DNA فوق الحلزوني [68 ، 69]. تراكيب الحمض النووي غير المتعارف عليها مثل الازدواج غير المتطابق ، الهياكل الصليبية [70] ، الحمض النووي المثني [71] ، الحمض النووي للكروماتين المرن هيكليًا [13] ، الحمض النووي المنزوع الدم [72] ، انتفاخات الحمض النووي ، الوصلات ثلاثية وأربعة الاتجاه [73] ، أو حلقات t telomeric [74] يمكن ربطها جميعًا بشكل انتقائي بـ p53. هناك علاقة قوية بين الأهداف المكونة للصليب وتعزيز ارتباط الحمض النووي لـ p53 [75]. التسلسلات المستهدفة قادرة على تكوين هياكل صليبية في الحمض النووي المقيد طوبولوجيًا المرتبط بـ p53 مع تقارب أعلى بشكل ملحوظ من الموقع المستهدف غير المتماثل داخليًا [76]. تشير هذه النتائج إلى أن طوبولوجيا الحمض النووي لها دور مهم في المجمع ، مع الآثار المحتملة في تعديل نظام p53.

البروتينات المرتبطة بالكروماتين

تغطي البروتينات المرتبطة بالكروماتين طيفًا واسعًا من البروتينات المترجمة في نواة الخلية. إنهم يشاركون جزئيًا في تعديل بنية الكروماتين ، لكنهم متورطون أيضًا في مجموعة من العمليات المرتبطة بوظيفة الحمض النووي. إنهم يقومون بضبط أحداث النسخ (DEK ، BRCA1) ويشاركوا في كل من إصلاح الحمض النووي والنسخ المتماثل (بروتينات HMG ، Rad51 ، Rad51ap ، الإيزوميراز العلوي). عائلة أخرى من الإنزيمات التي تعتبر مهمة في هذه العمليات هي عائلة توبويزوميراز. تحدث هذه الإنزيمات في جميع الكائنات الحية المعروفة وتلعب أدوارًا مهمة في إعادة تشكيل طوبولوجيا الحمض النووي. يرتبط Topoisomerase I بتقاطعات Holliday [77] ، ويتعرف Topoisomerase II على الهياكل الصليبية ويشقها [78] ويتفاعل مع بروتين HMGB1 [57]. هذه العمليات مهمة بشكل خاص للحفاظ على الاستقرار الجيني بسبب قدرتها على نشر الضغوط التي يتم فرضها على جزيء الحمض النووي أثناء النسخ والتكرار وحل الصليبات الطويلة التي من شأنها أن تعيق فصل سلسلة الحمض النووي. يلعب بروتين Rad54 دورًا مهمًا أثناء إعادة التركيب المتماثل في حقيقيات النوى [79]. ترتبط الخميرة والإنسان Rad54 على وجه التحديد بتقاطعات Holliday وتعزز هجرة الفروع [80]. يبدو أن تفضيل الربط للتشكيل المفتوح للتقاطع X شائع للعديد من البروتينات التي ترتبط بتقاطعات Holliday. يرتبط Human Rad54 بشكل تفضيلي بالتشكيل المفتوح للحمض النووي المتفرّع بدلاً من التشكل المكدس [48]. وبالمثل ، فإن بروتين RAD51AP1 ، وهو البروتين الإضافي RAD51 ، يحفز على وجه التحديد تكوين جزيئات المفصل من خلال الجمع بين ربط الحمض النووي الخاص بالهيكل وبالتفاعل مع RAD51. يمتلك RAD51AP1 تقاربًا خاصًا لهياكل الحمض النووي المتفرعة التي تعتبر وسيطًا إلزاميًا أثناء تكوين جزيء المفصل [81]. يعد التعرف على الهياكل المتفرعة أثناء إعادة التركيب المتماثل خطوة حاسمة في هذه العملية.

بروتين DEK البشري هو بروتين نووي وفير من 375 من الأحماض الأمينية التي تحدث بأعداد أكبر من مليون نسخة لكل نواة [82]. تشير تفاعلاتها مع المنشطات النسخية والمثبطات إلى أن DEK قد يكون له دور في تكوين مجمعات النسخ في مواقع المحفز والمعزز [تمت مراجعته في [83]]. إن ارتباط DEK بالحمض النووي ليس محددًا بالتسلسل ولدى DEK تفضيل واضح للوصلات فائقة الالتفاف وأربعة اتجاهات [84]. أظهر العمل مع DEK المعزول والمترابط أن له نشاطًا جوهريًا للربط بالحمض النووي مع تفضيل التقاطع رباعي الاتجاهات والحمض النووي الفائق على الحمض النووي الخطي ويقدم لفائف فائقة موجبة في DNA دائري مريح [83 ، 85]. يحتوي DEK على مجالين لربط الحمض النووي. يقع المجال الأول في موقع مركزي ويؤوي عنصر تسلسل محفوظ ، وهو SAF (عامل ربط السقالة). يقع مجال ربط الحمض النووي الثاني عند الطرف C لـ DEK والذي تم تعديله أيضًا بعد الترجمة عن طريق الفسفرة. في الواقع ، تتأثر خصائص ربط الحمض النووي لـ DEK بشكل واضح بالفسفرة حيث يرتبط DEK الفسفوري بتقارب أضعف مع الحمض النووي مقارنةً بـ DEK غير المعدل ويحث على تكوين متعدد DEK [86 ، 87]. لا يبدو أن صندوق SAF الأحادي الخاص بـ DEK (المخلفات 137-187) يتفاعل مع الحمض النووي في المحلول. ومع ذلك ، عندما يتم وضع العديد من صناديق SAF على مقربة ، يؤدي التعاون إلى ربط الحمض النووي. بناء DEK الذي يمتد على الأحماض الأمينية 87-187 يرتبط بالحمض النووي تمامًا مثل DEK السليم الذي يفضل تقاطعات الحمض النووي رباعية الاتجاهات على الحمض النووي الخطي. تشكل هذه القطعة مجاميع كبيرة في وجود الحمض النووي وهي أيضًا قادرة على إدخال لفائف فائقة في الحمض النووي الدائري المريح. ومن المثير للاهتمام ، أن ببتيد الأحماض الأمينية 87-187 يستحث الخلايا الفائقة للحمض النووي السالبة [88].

BRCA1

BRCA1 هو بروتين مثبط للورم متعدد الوظائف له دور في تقدم دورة الخلية والنسخ وإصلاح الحمض النووي وإعادة تشكيل الكروماتين. ترتبط الطفرات في جين BRCA1 بزيادة كبيرة في خطر الإصابة بسرطان الثدي. من المحتمل أن تتضمن وظيفة BRCA1 تفاعلات مع كل من الحمض النووي ومجموعة من البروتينات. يرتبط BRCA1 مباشرة بـ RAD51 وكلا البروتينين يتشاركان في التوطين في بؤر نواة فرعية منفصلة تعيد التوزيع إلى مواقع تلف الحمض النووي تحت الضغط السام الجيني [89]. كما يتم توطين BRCA1 مع H2AX الفسفوري (γH2AX) ردًا على فواصل الجدائل المزدوجة [90].

ترتبط المنطقة المركزية من BRCA1 البشري بقوة مع DNA البلازميد ذو الالتفاف الفائق ذو الكثافة الأصلية الفائقة [50] وترتبط بدرجة عالية من الارتباط بالحمض النووي الصليبي [91]. يجب أن ينفصل معقد الحمض النووي الصليبي BRCA1 للسماح لمركب نوكلياز بالعمل في إصلاح الحمض النووي المؤتلف للكسر المزدوج الذي تقطعت به السبل. يعمل BRCA1 أيضًا كسقالة لتجميع Rad51 ATPase المسؤول عن إعادة التركيب المتماثل في الخلايا الجسدية. يرتبط بروتين BRCA1 كامل الطول بقوة بالحمض النووي البلازميدي الفائق الالتفاف وبتقاطع الحمض النووي. كان الاختلاف في التقارب من 6 إلى 7 أضعاف بين الحمض النووي الخطي والتقاطع في التفاعلات التي تحتوي على مستويات فسيولوجية من المغنيسيوم [92]. يتحد BRCA1 230-534 مع تقارب أعلى للحمض النووي للوصلة الرباعية الاتجاه مقارنة بالحمض النووي المزدوج والحمض النووي أحادي السلسلة [91]. تم تحديد المخلفات 340-554 من BRCA1 على أنها الحد الأدنى من منطقة ربط الحمض النووي [93]. كانت أعلى درجة تقارب بين أهداف الحمض النووي المختلفة التي تحاكي الحمض النووي التالف (DNA الوصلات الرباعية ، وعدم تطابق الحمض النووي ، وانتفاخات الحمض النووي والحمض النووي الخطي) لتقاطعات الحمض النووي رباعية الاتجاهات. ولهذه الغاية ، لم يكن هناك فائض بمقدار 20 ضعفًا من الحمض النووي الخطي قادرًا على منافسة أي من BRCA1 230-534 المرتبط بجزيئات الحمض النووي التي تحاكي الحمض النووي التالف [49]. علاوة على ذلك ، فإن فقدان جين BRCA1 يمنع بقاء الخلية بعد التعرض للروابط المتقاطعة للحمض النووي مثل ميتوميسين سي [94]. تشير هذه النتائج إلى أهمية قدرة BRCA1 على التعرف على الهياكل الصليبية.

عائلة HMGB

إن بروتينات المجموعة عالية الحركة (HMG) هي عائلة من البروتينات غير الهيستون الوفيرة والمنتشرة في كل مكان والمعروف أنها ترتبط بالكروماتين حقيقي النواة. تتكون عائلات بروتين HMG الثلاثة من (أ) بروتينات HMGA (HMGI / Y سابقًا) التي تحتوي على أشكال ربط الحمض النووي A / T-hook ، (ب) بروتينات HMGB (المعروفة سابقًا باسم HMG1 / 2) التي تحتوي على مجال (مجالات) صندوق HMG ، و (ج) بروتينات HMGN (المعروفة سابقًا باسم HMG14 / 17) التي تحتوي على مجال ربط النواة [95].

ترتبط بروتينات HMGB بالحمض النووي بطريقة مستقلة عن التسلسل ومن المعروف أنها ترتبط ببعض هياكل الحمض النووي (تقاطعات رباعية الاتجاهات ، دوائر صغيرة للحمض النووي ، DNA ذات صفائح رابطة الدول المستقلة ، إلخ) ذات تقارب عالٍ مقارنة بالحمض النووي الخطي [96 ، 97]. يمكن أن يرتبط بروتين الكروماتين المعماري HMGB1 بألفة عالية جدًا بهياكل الحمض النووي التي تشكل حلقات الحمض النووي [72] ، في حين أظهرت دراسات أخرى أن صندوق HMG للبروتينات المختلفة يمكن أن يحفز ثني الحمض النووي [98-100]. صندوق HMG عبارة عن 80 مجال من الأحماض الأمينية الموجودة في مجموعة متنوعة من البروتينات الصبغية حقيقية النواة وعوامل النسخ. يرتبط ارتباط HMG بالحمض النووي بتشوهات في بنية الحمض النووي. يشارك أعضاء عائلة بروتين HMG في النسخ [101-103] وإصلاح الحمض النووي [57 ، 104 ، 105]. تم العثور على بروتين HMG T160 ليكون مترجمة مع بؤر تكرار الحمض النووي [106]. حقيقة أن جميع مجالات صندوق HMG ترتبط بوصلات الحمض النووي رباعية الاتجاهات تشير إلى أن السمة المشتركة في الأهداف الملزمة لعائلة البروتين هذه يجب أن تكون موجودة. تتفاعل مجالات صندوق HMG الفردي حصريًا مع الشكل المربع المفتوح للتقاطع ، والظروف التي تعمل على استقرار تشكيل الهيكل المكدس × يضعف بشكل كبير تفاعل DNA في صندوق HMG [107]. يتم إلغاء ارتباط المجال المعزول من بروتين HMGB1 إلى ركائز DNA رباعية الاتجاهات بواسطة طفرة في كل من Lys2 و Lys11 معًا إلى ألانين ، مما يشير إلى أن هذه البقايا تلعب دورًا مهمًا في ربط الحمض النووي [108].

تشارك البروتينات في النسخ المتماثل

التحولات العابرة من B-DNA إلى الهياكل الصليبية ترتبط بتكاثر ونسخ الحمض النووي [109]. لقد ثبت أن الصليب الصليبي يعمل كإشارات التعرف على أصول حقيقية النواة أو بالقرب منها لتكاثر الحمض النووي [110-112]. There are a large number of proteins involved in replication which bind to cruciform structures (see Table 1). We focus here primarily on the 14-3-3 protein family and MLL and WRN proteins. We will comment briefly on other systems of interest.

S16 is a structure-specific DNA-binding protein displaying preferential binding for cruciform DNA structures [113]. The AF10 protein binds cruciform DNA via a specific interaction with an AT-hook motif and is localized to the nucleus by a defined bipartite nuclear localization signal in the N-terminal region [114]. The structural maintenance of chromosomes (SMC) protein family, with members from lower and higher eukaryotes, may be divided into four subfamilies (SMC1 to SMC4) and two SMC-like protein subfamilies (SMC5 and SMC6) [115–117]. Members of this family are implicated in a large range of activities that modulate chromosome structure and organization. Smc1 and smc2 proteins have a high affinity for cruciform DNA molecules and for AT-rich DNA fragments including fragments from the scaffold-associated regions [118]. The baculovirus very late expression factor 1 (VLF-1), a member of the integrase protein family, does not bind to single and double strand structures, but it does bind (listed with increasing affinity) to Y-forks, three-way junctions and cruciform structures. This protein is involved in the processing of branched DNA molecules at the late stages of viral genome replication [119].

The 14-3-3 protein family consists of a highly conserved and widely distributed group of dimeric proteins which occur as multiple isoforms in eukaryotes [120]. There are at least seven distinct 14-3-3 genes in vertebrates, giving rise to nine isoforms (α, β, γ, δ, ε, ζ, η, σ and τ) and at least another 20 have been identified in yeast, plants, amphibians and invertebrates [110]. A striking feature of the 14-3-3 proteins is their ability to bind a multitude of functionally diverse signaling proteins, including kinases, phosphatases, and transmembrane receptors. This plethora of proteins allows 14-3-3s to modulate a wide variety of vital regulatory processes, including mitogenic signal transduction, apoptosis and cell cycle regulation [121]. The 14-3-3 proteins are found mainly within the nucleus and are involved in eukaryotic DNA replication via binding to the cruciform DNA that forms transiently at replication origins at the onset of the S phase [122].

14-3-3 cruciform binding activity was first observed in proteins purified from sheep's brain. More recently, immunofluorescence analyses showed that 14-3-3 isoforms with cruciform-binding activity are present in HeLa cells [123]. The direct interaction with cruciform DNA was confirmed with 14-3-3 isoforms β, γ, σ, ε, and ζ [34]. 14-3-3 analogs with cruciform-specific binding are also found in yeast (Bmh1 and Bmh2) and plants (GF14) [35].

The prevalence of the 14-3-3 family proteins in all eukaryotes combined with a high degree of sequence conservation between species is indicative of their importance. Genetic studies have shown that knocking out the yeasts homologs of the 14-3-3 proteins is lethal [124]. Moreover, 14-3-3 proteins are involved in interactions with numerous transcription factors and it has been reported that several of the 14-3-3 proteins functions are associated with its cruciform binding properties.

Mixed lineage leukemia (MLL) protein

The MLL gene encodes a putative transcription factor with regions of homology to several other proteins including the zinc fingers and the so-called "AT-hook" DNA-binding motif of high mobility group proteins [125]. The 11q23 chromosomal translocation, found in both acute lymphoid and myeloid leukemias, results in disruption of the MLL gene. Leukemogenesis is often correlated with alternations in chromatin structure brought about by either a gain or loss in function of the regulatory factors due to their being disrupted by chromosomal translocations. The MLL gene, a target of such translocation events, forms a chimeric fusion product with a variety of partner genes [126].

The MLL AT-hook domain binds cruciform DNA, recognizing the structure rather than the sequence of the target DNA. This interaction can be antagonized both by Hoechst 33258 dye and distamycin. In a nitrocellulose protein-DNA binding assay, the MLL AT-hook domain was shown to bind to AT-rich SARs, but not to non-SAR DNA fragments [125]. MLL appears to be involved in chromatin-mediated gene regulation. In translocations involving MLL, the loss of the activation domain combined with the retention of a repression domain alters the expression of downstream target genes, thus suggesting a potential mechanism of action for MLL in leukemia [126]. AF10 translocations to the vicinity of genes other than MLL also result in myeloid leukemia. A biochemical analysis of the MLL partner gene AF10 showed that its AT-hook motif is able to bind to cruciform DNA, but not to double-stranded DNA, and that it forms a homo-tetramer في المختبر[114].

The Werner syndrome protein belongs to the RecQ family of evolutionary conserved 3' → 5' DNA helicases [127]. WRN encodes a single polypeptide of 162 kDa that contains 1432 amino acids. Prokaryotes and lower eukaryotes generally have one RecQ member while higher eukaryotes possess multiple members and five homologs have been identified in human cells. All RecQ members share a conserved helicase core with one or two additional C-terminal domains, the RQC (RecQ C-terminal) and HRDC (helicase and RNaseD C-terminal) domains. These domains bind both to proteins and DNA. Eukaryotic RecQ helicases have N- and C-terminal extensions that are involved in protein-protein interactions and have been postulated to lend unique functional characteristics to these proteins [55, 128]. WRN has been shown to bind at replication fork junctions and to Holliday junction structures. Binding to junction DNA is highly specific because little or no WRN binding is visualized at other sites along these substrates [129]. Upon binding to DNA, WRN assembles into a large complex composed of four monomers.

Cruciform binding proteins and disease

The recognition of DNA junctions and cruciform structures is critical for genomic stability and for the regulation of basic cellular processes. The resolution of Holliday junctions and long cruciforms is necessary for genomic stability where the dysregulation of these proteins can lead to DNA translocations, deletions, loss of genomics stability and carcinogenesis. The large numbers of proteins which bind to these DNA structures work together to keep the genome intact. We believe that the formation of cruciform structures serves as a marker for the proper timing and initiation of some very basic biological processes. The mutations and epigenetic modifications that alter the propensity for cruciform formation can have drastic consequences for cellular processes. Thus, it is unsurprising that the dysregulation of cruciform binding proteins is often associated with the pathology of disease.

As stated above, the cruciform binding proteins including p53, BRCA1, WRN and the proto-oncogenes DEK, MLL and HMG are also associated with cancer development and/or progression. Some of these proteins play such important roles that their mutation and/or inactivation result in severe genomic instability and sometimes lethality. For example, Brca1 -/- mouse embryonic stem cells show spontaneous chromosome breakage, profound genomic instability and hypersensitivity to a variety of damaging agents (e.g. γ radiation) all of which suggests a defect in DNA repair. The connection between the BRCA1 mutation and breast cancer is well known. P53's transcriptional regulation is fine-tuned by its timely binding to promoter elements. The formation of a cruciform structure in p53 recognition elements may be an important determinant of p53 transcription activity.

The dHMGI(Y) family of "high mobility group" non-histone proteins comprises architectural transcription factors whose over expression is highly correlated with carcinogenesis, increased malignancy and metastatic potential of tumors في الجسم الحي[95]. 14-3-3 proteins are related to several diseases, including cancer, Alzeheimer's disease, the neurological Miller Dieker and Spinocerebellar ataxia type 1 diseases, and spongiform encephalopathy. The deletion of 14-3-3σ in human colorectal cancer cells leads to the loss of the DNA damage checkpoint control [130]. The human DEK protein was discovered as a fusion with a nuclear pore protein in a subset of patients with acute myeloid leukemia. It was also identified as an autoantigen in a relatively high percentage of patients with autoimmune diseases. In addition, DEK mRNA levels are higher in transcriptionally active and proliferating cells than in resting cells, and elevated mRNA levels are found in several transformed and cancer cells [6, 7]. Werner syndrome is an autosomal recessive disorder characterized by features of premature aging and a high incidence of uncommon cancers [127]. The Werner syndrome protein (WRN) plays central roles in maintaining the genomic stability of organisms [131]. Individuals harboring mutations in WRN have a rare, autosomal recessive genetic disorder manifested by early onset of symptoms characteristic of aged individuals.


DNA Function

DNA stores the information needed to build and control the cell. The transmission of this information from mother to daughter cells is called vertical gene transfer and it occurs through the process of DNA replication. DNA is replicated when a cell makes a duplicate copy of its DNA, then the cell divides, resulting in the correct distribution of one DNA copy to each resulting cell. DNA can also be enzymatically degraded and used as a source of nucleotides for the cell. Unlike other macromolecules, DNA does not serve a structural role in cells.

The elucidation of the structure of the double helix by James Watson and Francis Crick in 1953 provided a hint as to how DNA is copied during the process of replication. سيوفر فصل خيوط اللولب المزدوج نموذجين لتوليف خيوط تكميلية جديدة ، ولكن بالضبط كيف تم بناء جزيئات الحمض النووي الجديدة لا يزال غير واضح. In one model, semiconservative replication, the two strands of the double helix separate during DNA replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied after replication, each double-stranded DNA includes one parental or &ldquoold&rdquo strand and one &ldquonew&rdquo strand. There were two competing models also suggested: conservative and dispersive, which are shown in Figure (PageIndex<10>).

Figure (PageIndex<10>): There were three models suggested for DNA replication. In the conservative model, parental DNA strands (blue) remained associated in one DNA molecule while new daughter strands (red) remained associated in newly formed DNA molecules. In the semiconservative model, parental strands separated and directed the synthesis of a daughter strand, with each resulting DNA molecule being a hybrid of a parental strand and a daughter strand. In the dispersive model, all resulting DNA strands have regions of double-stranded parental DNA and regions of double-stranded daughter DNA.

Matthew Meselson (1930&ndash) and Franklin Stahl (1929&ndash) devised an experiment in 1958 to test which of these models correctly represents DNA replication. لقد نموا بكتريا قولونية for several generations in a medium containing a &ldquoheavy&rdquo isotope of nitrogen ( 15 N) that was incorporated into nitrogenous bases and, eventually, into the DNA. هذا المسمى الحمض النووي للوالدين. ال بكتريا قولونية تم بعد ذلك تحويل الثقافة إلى وسط يحتوي على 14 نيوتن والسماح لها بالنمو لجيل واحد. تم حصاد الخلايا وعزل الحمض النووي. تم فصل الحمض النووي عن طريق التنبيذ الفائق ، حيث شكل الحمض النووي العصابات وفقًا لكثافته. من المتوقع أن يشكل الحمض النووي الذي ينمو في 15 نيوتن نطاقًا عند موضع كثافة أعلى من تلك التي نمت في 14 N. نمت الخلايا حصريًا في 15 نيوتن أو 14 نيوتن. وهذا يقترح إما وضع شبه محافظ أو مشتت للنسخ المتماثل. تم السماح لبعض الخلايا بالنمو لجيل آخر في 14 نيوتن ونسجها مرة أخرى. شكل الحمض النووي المأخوذ من الخلايا التي نمت على مدى جيلين في 14 نيوتن شريطين: شريط واحد للحمض النووي كان في الموضع المتوسط ​​بين 15 نيوتن و 14 نيوتن ، والآخر يتوافق مع نطاق 14 نيوتن. لا يمكن تفسير هذه النتائج إلا إذا تكرر الحمض النووي بطريقة شبه محافظة. لذلك ، تم استبعاد النموذجين الآخرين. نتيجة لهذه التجربة ، نعلم الآن أنه أثناء تكرار الحمض النووي ، يعمل كل من الخيطين اللذين يشكلان الحلزون المزدوج كقالب تُنسخ منه خيوط جديدة. The new strand will be complementary to the parental or &ldquoold&rdquo strand. جزيئات الحمض النووي الناتجة لها نفس التسلسل وتنقسم بالتساوي إلى خليتين ابنتيتين. This means the middle explanation from Figure (PageIndex<10>) is correct.

تكرار الحمض النووي في البكتيريا

تمت دراسة تكاثر الحمض النووي جيدًا في البكتيريا في المقام الأول بسبب صغر حجم الجينوم والطفرات المتوفرة. بكتريا قولونية يحتوي على 4.6 مليون زوج أساسي (Mbp) في كروموسوم دائري واحد ويتم تكرار كل ذلك في حوالي 42 دقيقة ، بدءًا من أصل واحد للنسخ المتماثل والمضي قدمًا حول الدائرة بشكل ثنائي الاتجاه (أي في كلا الاتجاهين). هذا يعني أنه يتم إضافة ما يقرب من 1000 نيوكليوتيد في الثانية. العملية سريعة جدًا وتحدث مع أخطاء قليلة.

DNA replication uses a large number of proteins and enzymes (Table (PageIndex<1>)). One of the key players is the enzyme DNA polymerase, also known as DNA pol. في البكتيريا ، تُعرف ثلاثة أنواع رئيسية من بوليميرات الحمض النووي: DNA pol I و DNA pol II و DNA pol III. من المعروف الآن أن DNA pol III هو الإنزيم المطلوب لتخليق الحمض النووي DNA pol I و DNA pol II مطلوبان بشكل أساسي للإصلاح. DNA pol III adds deoxyribonucleotides each complementary to a nucleotide on the template strand, one by one to the 3&rsquo-OH group of the growing DNA chain. تتطلب إضافة هذه النيوكليوتيدات طاقة. This energy is present in the bonds of three phosphate groups attached to each nucleotide (a triphosphate nucleotide), similar to how energy is stored in the phosphate bonds of adenosine triphosphate (ATP) (Figure (PageIndex<11>)). When the bond between the phosphates is broken and diphosphate is released, the energy released allows for the formation of a covalent phosphodiester bond by dehydration synthesis between the incoming nucleotide and the free 3&rsquo-OH group on the growing DNA strand.

Figure (PageIndex<11>): This structure shows the guanosine triphosphate deoxyribonucleotide that is incorporated into a growing DNA strand by cleaving the two end phosphate groups from the molecule and transferring the energy to the sugar phosphate bond. The other three nucleotides form analogous structures.

Initiation

The initiation of replication occurs at specific nucleotide sequence called the origin of replication, where various proteins bind to begin the replication process. بكتريا قولونية له أصل واحد من النسخ المتماثل (كما تفعل معظم بدائيات النوى) ، يسمى oriC، على كروموسومه الواحد. يبلغ أصل النسخ المتماثل حوالي 245 زوجًا قاعديًا وهو غني بتسلسلات الأدينين - الثايمين (AT).

بعض البروتينات التي ترتبط بأصل النسخ المتماثل مهمة في جعل مناطق الحمض النووي أحادية الشريطة متاحة للتكاثر. Chromosomal DNA is typically wrapped around histones (in eukaryotes and archaea) or histone-like proteins (in bacteria), and is supercoiled, or extensively wrapped and twisted on itself. تجعل هذه العبوة المعلومات الموجودة في جزيء الحمض النووي غير قابلة للوصول. However, enzymes can change the shape and supercoiling of the chromosome. For bacterial DNA replication to begin, the supercoiled chromosome is relaxed. يقوم إنزيم يسمى هيليكاز بعد ذلك بفصل خيوط الحمض النووي عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القاعدة النيتروجينية. تذكر أن متواليات AT لها روابط هيدروجينية أقل ، وبالتالي لها تفاعلات أضعف من تسلسلات الجوانين والسيتوزين (GC). تتطلب هذه الإنزيمات تحلل ATP المائي. As the DNA opens up, Y-shaped structures called replication forks are formed. Two replication forks are formed at the origin of replication, allowing for bidirectional replication and formation of a structure that looks like a bubble when viewed with a transmission electron microscope as a result, this structure is called a replication bubble. يتم تغليف الحمض النووي بالقرب من كل شوكة تكرار ببروتينات ربط أحادية السلسلة لمنع الحمض النووي أحادي السلسلة من اللف إلى حلزون مزدوج.

بمجرد الوصول إلى الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل في أصل النسخ المتماثل ، يمكن أن يبدأ تكرار الحمض النووي. However, DNA pol III is able to add nucleotides only in the 5&rsquo to 3&rsquo direction (a new DNA strand can be only extended in this direction). This is because DNA polymerase requires a free 3&rsquo-OH group to which it can add nucleotides by forming a covalent phosphodiester bond between the 3&rsquo-OH end and the 5&rsquo phosphate of the next nucleotide. This also means that it cannot add nucleotides if a free 3&rsquo-OH group is not available, which is the case for a single strand of DNA. The problem is solved with the help of an RNA sequence that provides the free 3&rsquo-OH end. Because this sequence allows the start of DNA synthesis, it is appropriately called the primer. يتكون التمهيدي من خمسة إلى 10 نيوكليوتيدات طويلة ومكملة للحمض النووي الأبوي أو النموذجي. It is synthesized by RNA primase, which is an RNA polymerase. Unlike DNA polymerases, RNA polymerases do not need a free 3&rsquo-OH group to synthesize an RNA molecule. Now that the primer provides the free 3&rsquo-OH group, DNA polymerase III can now extend this RNA primer, adding DNA nucleotides one by one that are complementary to the template strand.

استطالة

During elongation in DNA replication, the addition of nucleotides occurs at its maximal rate of about 1000 nucleotides per second. DNA polymerase III can only extend in the 5&rsquo to 3&rsquo direction, which poses a problem at the replication fork. The DNA double helix is antiparallel that is, one strand is oriented in the 5&rsquo to 3&rsquo direction and the other is oriented in the 3&rsquo to 5&rsquo direction. During replication, one strand, which is complementary to the 3&rsquo to 5&rsquo parental DNA strand, is synthesized continuously toward the replication fork because polymerase can add nucleotides in this direction. يُعرف هذا الخيط المركب باستمرار باسم الخيط الرئيسي. The other strand, complementary to the 5&rsquo to 3&rsquo parental DNA, grows away from the replication fork, so the polymerase must move back toward the replication fork to begin adding bases to a new primer, again in the direction away from the replication fork. It does so until it bumps into the previously synthesized strand and then it moves back again (Figure (PageIndex<12>)). These steps produce small DNA sequence fragments known as Okazaki fragments, each separated by RNA primer. Okazaki fragments are named after the Japanese research team and married couple Reiji and Tsuneko Okazaki, who first discovered them in 1966. The strand with the Okazaki fragments is known as the lagging strand, and its synthesis is said to be discontinuous.

Figure (PageIndex<12>): At the origin of replication, topoisomerase II relaxes the supercoiled chromosome. Two replication forks are formed by the opening of the double-stranded DNA at the origin, and helicase separates the DNA strands, which are coated by single-stranded binding proteins to keep the strands separated. DNA replication occurs in both directions. An RNA primer complementary to the parental strand is synthesized by RNA primase and is elongated by DNA polymerase III through the addition of nucleotides to the 3&rsquo-OH end. On the leading strand, DNA is synthesized continuously, whereas on the lagging strand, DNA is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. RNA primers within the lagging strand are removed by the exonuclease activity of DNA polymerase I, and the Okazaki fragments are joined by DNA ligase.

يمكن تمديد الخيط الرئيسي من أساس واحد فقط ، بينما يحتاج الخيط المتأخر إلى مادة أولية جديدة لكل جزء من أجزاء أوكازاكي القصيرة. The overall direction of the lagging strand will be 3&rsquo to 5&rsquo, and that of the leading strand 5&rsquo to 3&rsquo. يحافظ بروتين يسمى المشبك المنزلق على بوليميريز الحمض النووي في مكانه بينما يستمر في إضافة النيوكليوتيدات. المشبك المنزلق عبارة عن بروتين على شكل حلقة يرتبط بالحمض النووي ويثبت البوليميراز في مكانه. As synthesis proceeds, the RNA primers are replaced by DNA by the exonuclease activity of DNA polymerase I, and the gaps are filled in. Any nicks that remain between the newly synthesized DNA (that replaced the RNA primer) and the previously synthesized DNA are sealed by the enzyme DNA ligase, stabilizing the sugar-phosphate backbone of the DNA molecule.

نهاية

بمجرد تكرار الكروموسوم الكامل ، يجب أن يحدث إنهاء لتكرار الحمض النووي. على الرغم من معرفة الكثير عن بدء النسخ المتماثل ، إلا أنه لا يُعرف الكثير عن عملية الإنهاء. بعد النسخ المتماثل ، تكون الجينومات الدائرية الكاملة الناتجة عن بدائيات النوى متسلسلة ، مما يعني أن كروموسومات الحمض النووي الدائرية متشابكة ويجب فصلها عن بعضها البعض. يتم تحقيق ذلك من خلال نشاط توبويزوميراز 4 البكتيري ، والذي يقدم فواصل مزدوجة الجديلة في جزيئات الحمض النووي ، مما يسمح لها بالانفصال عن بعضها البعض ، ثم يعيد الإنزيم إحكام غلق الكروموسومات الدائرية. يعد حل الكواتر مشكلة فريدة من نوعها لتكرار الحمض النووي بدائية النواة بسبب كروموسوماتها الدائرية. Because both bacterial DNA gyrase and topoisomerase IV are distinct from their eukaryotic counterparts, these enzymes serve as targets for a class of antimicrobial drugs called quinolones.

  1. ما هو الإنزيم الذي يكسر روابط الهيدروجين التي تربط شريطين من الحمض النووي معًا بحيث يمكن أن يحدث النسخ المتماثل؟
  2. هل هو الخيط المتأخر أم الخيط الرئيسي الذي يتم تصنيعه في الاتجاه نحو فتح شوكة النسخ المتماثل؟
  3. ما هو الإنزيم المسؤول عن إزالة المواد الأولية للحمض النووي الريبي في الحمض النووي البكتيري الجديد؟

تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى

Eukaryotic genomes are much more complex and larger than prokaryotic genomes and are typically composed of multiple linear chromosomes (Table (PageIndex<2>)). The human genome, for example, has 3 billion base pairs per haploid set of chromosomes, and 6 billion base pairs are inserted during replication. There are multiple origins of replication on each eukaryotic chromosome (Figure (PageIndex<13>)) the human genome has 30,000 to 50,000 origins of replication. The rate of replication is approximately 100 nucleotides per second&mdash10 times slower than prokaryotic replication.

Figure (PageIndex<13>): Eukaryotic chromosomes are typically linear, and each contains multiple origins of replication.

الخطوات الأساسية للنسخ المتماثل في حقيقيات النوى هي نفسها كما في بدائيات النوى. قبل أن يبدأ النسخ المتماثل ، يجب توفير الحمض النووي كقالب. Eukaryotic DNA is highly supercoiled and packaged, which is facilitated by many proteins, including histones. At the origin of replication, a prereplication complex composed of several proteins, including helicase, forms and recruits other enzymes involved in the initiation of replication, including topoisomerase to relax supercoiling, single-stranded binding protein, RNA primase, and DNA polymerase. بعد بدء النسخ المتماثل ، في عملية مماثلة لتلك الموجودة في بدائيات النوى ، يتم تسهيل الاستطالة بواسطة بوليميراز DNA حقيقي النواة. The leading strand is continuously synthesized by the eukaryotic polymerase enzyme pol &delta, while the lagging strand is synthesized by pol &epsilon. يحافظ بروتين المشبك المنزلق على بوليميراز الحمض النووي في مكانه بحيث لا يسقط من الحمض النووي. The enzyme ribonuclease H (RNase H), instead of a DNA polymerase as in bacteria, removes the RNA primer, which is then replaced with DNA nucleotides. The gaps that remain are sealed by DNA ligase.

نظرًا لأن الكروموسومات حقيقية النواة خطية ، فقد يتوقع المرء أن يكون تكرارها أكثر وضوحًا. As in prokaryotes, the eukaryotic DNA polymerase can add nucleotides only in the 5&rsquo to 3&rsquo direction. في الخيط الرئيسي ، يستمر التوليف حتى يصل إما إلى نهاية الكروموسوم أو شوكة نسخ أخرى تتقدم في الاتجاه المعاكس. على الخيط المتأخر ، يتم تصنيع الحمض النووي في امتدادات قصيرة ، كل منها يبدأ بواسطة تمهيدي منفصل. عندما تصل شوكة النسخ إلى نهاية الكروموسوم الخطي ، لا يوجد مكان لعمل تمهيدي لجزء الحمض النووي ليتم نسخه في نهاية الكروموسوم. وهكذا تظل هذه الغايات غير متزاوجة ، وقد تصبح أقصر بمرور الوقت مع استمرار الخلايا في الانقسام.

The ends of the linear chromosomes are known as telomeres and consist of noncoding repetitive sequences. تحمي التيلوميرات متواليات التشفير من الضياع مع استمرار الخلايا في الانقسام. في البشر ، يتكرر تسلسل ستة أزواج أساسية ، TTAGGG ، من 100 إلى 1000 مرة لتشكيل التيلومير. The discovery of the enzyme telomerase clarified our understanding of how chromosome ends are maintained. يحتوي التيلوميراز على جزء محفز وقالب مدمج للحمض النووي الريبي. It attaches to the end of the chromosome, and complementary bases to the RNA template are added on the 3&rsquo end of the DNA strand. Once the 3&rsquo end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. بهذه الطريقة ، يتم تكرار نهايات الكروموسومات. في البشر ، ينشط الإنزيم تيلوميراز عادة في الخلايا الجرثومية والخلايا الجذعية البالغة ، ولا يكون نشطًا في الخلايا الجسدية البالغة وقد يترافق مع شيخوخة هذه الخلايا. الميكروبات حقيقية النواة بما في ذلك الفطريات والأوليات تنتج أيضًا تيلوميراز للحفاظ على سلامة الكروموسومات. For her discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn (1948&ndash) received the Nobel Prize for Medicine or Physiology in 2009.


محتويات

The formation of a stem-loop structure is dependent on the stability of the resulting helix and loop regions. The first prerequisite is the presence of a sequence that can fold back on itself to form a paired double helix. The stability of this helix is determined by its length, the number of mismatches or bulges it contains (a small number are tolerable, especially in a long helix) and the base composition of the paired region. Pairings between guanine and cytosine have three hydrogen bonds and are more stable compared to adenine-uracil pairings, which have only two. In RNA, adenine-uracil pairings featuring two hydrogen bonds are equal to the adenine-thymine bond of the DNA. Base stacking interactions, which align the pi bonds of the bases' aromatic rings in a favorable orientation, also promote helix formation.

The stability of the loop also influences the formation of the stem-loop structure. "Loops" that are fewer than three bases long are sterically impossible and do not form. Large loops with no secondary structure of their own (such as pseudoknot pairing) are also unstable. Optimal loop length tends to be about 4-8 bases long. One common loop with the sequence UUCG is known as the "tetraloop" and is particularly stable due to the base-stacking interactions of its component nucleotides.

Stem-loops occur in pre-microRNA structures and most famously in transfer RNA, which contain three true stem-loops and one stem that meet in a cloverleaf pattern. The anticodon that recognizes a codon during the translation process is located on one of the unpaired loops in the tRNA. Two nested stem-loop structures occur in RNA pseudoknots, where the loop of one structure forms part of the second stem.

Many ribozymes also feature stem-loop structures. The self-cleaving hammerhead ribozyme contains three stem-loops that meet in a central unpaired region where the cleavage site lies. The hammerhead ribozyme's basic secondary structure is required for self-cleavage activity.

Hairpin loops are often elements found within the 5'UTR of prokaryotes. These structures are often bound by proteins or cause the attenuation of a transcript in order to regulate translation. [2]

The mRNA stem-loop structure forming at the ribosome binding site may control an initiation of translation. [3] [4]

Stem-loop structures are also important in prokaryotic rho-independent transcription termination. The hairpin loop forms in an mRNA strand during transcription and causes the RNA polymerase to become dissociated from the DNA template strand. This process is known as rho-independent or intrinsic termination, and the sequences involved are called terminator sequences.


بروس ألبرتس

Bruce Alberts is currently the Chancellor’s Leadership Chair in Biochemistry and Biophysics for Science and Education at the University of California, San Francisco, and served as Editor-in-Chief of Science Magazine (2008-2013), President of the National Academy of Sciences (1993-2005), and United States Science Envoy (2009-2011). Alberts, who has dedicated his career to promoting science education and international… Continue Reading


DNA 'Palindromes' Linked To Disease

In the past 10 years, researchers in genome stability have observed that many kinds of cancers are associated with areas where human chromosomes break. More recently, scientists have discovered that slow or altered replication causes chromosomal breaking. But why does DNA replication stall?

In a Tufts University study published in the July 14 issue of Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, a team of biologists have found a relationship between peculiar DNA sequences named palindromes and replication delays.

Sergei Mirkin, White Family Professor of Biology at Tufts' School of Arts and Sciences, along with his graduate student Irina Voineagu and collaborators Kirill Lobachev and Vidhya Narayanan from the Georgia Institute of Technology explored the heretofore elusive function of long palindromes in DNA replication.

Mirkin and his team studied palindrome behavior in bacterial, yeast and mammalian cells because they allowed them to monitor DNA replication in a more detailed way than looking at actual human chromosomes. Based on previous studies in model systems, they expect their results to be applicable for human chromosomes.

Abnormally shaped DNA blocks molecule's replication

In the context of everyday life, palindromes are quite common, said Mirkin. They are words, phrases, numbers or other sequences of units that read the same way in either direction. "We all enjoy palindromes in everyday language, such as 'A man, a plan, a canal -- Panama!' They are short, make perfect sense and are easy to remember," he explained. The problems begin when they become longer. "They stop making sense," he said. "For example, say 'A man, a plan, a cat, a ham, a yak, a yam, a hat, a canal-Panama!'"

Past DNA research had shown that long palindromes change the shape of the molecule from a double helix into a hairpin or cruciform like structure in a test tube. It was not known, however, whether these changes can occur inside cells and, if so, affect DNA functioning. In this study, the researchers found that large palindromes stall the replication machinery.

"Replication is carried out by a complex and sophisticated machinery, which has many levels of checks and balances to prevent 'typos' from happening. Long DNA palindromes, however, can occasionally jam this powerful replication machinery," Mirkin explained. The researchers were also able to pinpoint the exact structure causing DNA malfunction. "In all cases it was the formation of the hairpin-like DNA structure in a palindrome that caused the replication to stall," he said.

Other scientists have previously found that when replication slows down, chromosomes break. "Stalled DNA replication could result in the chromosomal breakage during cell division, explaining why DNA palindromes are genomic weak spots."

The study of yeast cells yielded an additional finding. Mirkin and his team found that two proteins within the cell - Tof1 and Mrc1 - enabled replication to proceed through the hairpin-like DNA structures. "These proteins might be key players in protecting the genome from breaking at DNA palindromes," said Mirkin.

Mirkin said he has begun experiments to see if the same results will be observed with human homologues of these proteins.

Mirkin's research was funded by the National Institutes of Health.

مصدر القصة:

المواد المقدمة من Tufts University. ملاحظة: يمكن تعديل المحتوى حسب النمط والطول.


مقدمة

Repeated sequences are present in all genomes and are particularly abundant in eukaryotes, where runs of mono-, di- and trinucleotide repeats, known as microsatellite sequences, can represent a sizeable proportion of the genetic material. These repeats, which are present in coding and non-coding regions ( Toth وآخرون., 2000 ), exhibit a strong level of instability, undergoing additions or deletions of repeated units, which lead to variations in the number of copies of the repeated stretches. These variations were thus named ‘dynamic mutations’ ( Richards and Sutherland, 1992 ). A number of studies on deletions and expansions of repeated sequences were prompted by the observation of a correlation between triplet expansion and certain human genetic diseases (for reviews see Richards and Sutherland, 1994 Hancock and Santibanez-Koref, 1998 ). Alteration in the number of repeats of mono-, di- or trinucleotides is linked to hereditary non-polyposis colon cancer and other human cancers ( Richards and Sutherland, 1994 Djian, 1998 ). Neurodegenerative diseases are associated with a modification of the length polymorphism of simple repeats, where expansions of the following triplet repeats, CCG·CGG, CTG·CAG and GAA·TTC, account for most of the cases (for reviews see Wells, 1996 Mitas, 1997 ). In prokaryotes, highly repeated sequences are less common, but recombination between short repeats is also a major cause of genome instability ( Ehrlich وآخرون., 1993 van Belkum وآخرون., 1998 Michel, 2000 ).

A replication slippage model, also known as copy-choice recombination, was proposed as a possible mechanism to account for formation of dynamic mutations ( Tautz and Schlotterer, 1994 Wells, 1996 Pearson and Sinden, 1998a , b Petruska وآخرون., 1998 ). It was shown that replication slippage does indeed take place في الجسم الحي، في الإشريكية القولونية, between short direct repeats (DRs) and probably also between longer tandem repeats ( Lovett وآخرون., 1993 d'Alencon وآخرون., 1994 Bierne وآخرون., 1997b ). Direct evidence that different DNA polymerases can undergo replication slippage was also provided في المختبر ( Canceill and Ehrlich, 1996 Canceill وآخرون، 1999). An experimental system that mimics the replication of the lagging DNA strand was used in these studies, involving a single-stranded DNA (ssDNA) template that carries two short DRs flanking a hairpin structure formed by annealing of two long inverted repeats (IRs). ثلاثة بكتريا قولونية DNA polymerases (I, II and III) slip between the DR on this template, as do DNA polymerases from the thermophilic microorganisms ثيرموس أكواتيكوس, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus abyssi و Thermococcus littoralis, or from phages T4 (T4 pol) and T7 (T7 pol) ( Canceill and Ehrlich, 1996 Canceill وآخرون., 1999 E.Viguera, D.Canceill and S.D.Ehrlich, submitted). In contrast, the polymerases endowed with high strand displacement activity and therefore able to enter the hairpin and progress within it, such as phage Φ29 DNA polymerase and the thermostable Bacillus stearothermophilus DNA polymerase, do not slip. Furthermore, factors that stimulate the strand displacement activity of polymerases, such as the single-stranded DNA-binding protein (SSB) or specific point mutations in the polymerase exonuclease domain, interfere with slippage ( Canceill وآخرون., 1999 E.Viguera, D.Canceill and S.D.Ehrlich, submitted).

Based on these observations, we proposed the following model for the slippage process: (i) polymerase replicates a DR (ii) it is arrested and dissociates from the newly synthesized strand (iii) this strand separates from the template and realigns with another DR and (iv) poly merase reloads and replication resumes. This model presents similarities with that invoked to account for so-called translesion synthesis (TLS). It is thought that during TLS, the main replicative polymerase is arrested by a bulky lesion and dissociates from the template (for a review see Baynton and Fuchs, 2000 ). This allows extension of the newly synthesized strand, either directly by a specialized polymerase capable of inserting a nucleotide opposite to the lesion, or, in accord with the slippage model, after the realignment of the tip of the newly synthesized strand with a homologous nucleotide positioned beyond the lesion ( Napolitano وآخرون، 2000). The latter process, which also relies upon specialized polymerases, such as بكتريا قولونية DNA polymerase II, IV or V, leads to a loss of one or two nucleotides and therefore generates frameshift mutations. In contrast, two different models were proposed for slippage of mononucleotide runs by DNA polymerase III holoenzyme from بكتريا قولونية (pol III HE) في المختبر, which generates frameshift mutations ( Seki وآخرون., 1999 ): the ‘melting–misalignment model’, which involves misalignment of the tract inside the DNA polymerase and therefore no DNA polymerase dissociation and the ‘misinsertion–misalignment model’, which involves polymerase dissociation, spontaneous realignment of the terminal nucleotide and resumption of DNA synthesis.

In this work, we addressed the two key steps of the replication slippage model: the arrest and dissociation of the polymerase, which were postulated but never directly demonstrated. We show that pausing of the polymerase within the DR is necessary for slippage and that the pausing polymerase dissociates prior to the strand realignment. These results not only strengthen the model of the replication slippage, but also lend credence to the model proposed for TLS ( Napolitano وآخرون، 2000). They lead to a better understanding of the genome rearrangements that involve short repeated sequences and to the process of mutagenesis, which involves nucleotide loss.


Analysis of the Mechanism of DNA Damage and Replication Arrest-induced Histone mRNA Decay Pornpen Panomwan*and Carl Smythe

Histone mRNA decay (HD) is the process which ensures that histone mRNA is rapidly degraded following completion of DNA replication at the end of S-phase. Strict coordination between histone protein production and DNA replication is essential for the correct packaging of newly replicated DNA, as imbalances can lead to deleterious effects such as genomic instability. Interestingly, histone mRNA stability is controlled by the presence of a stem-loop structure at the 3' end of histone mRNA, and a protein, HBP/SLBP (hairpin/stem loop binding protein) which specifically binds to this structure, plays a major role in histone mRNA metabolism. Importantly, previous studies have shown HD is also one functional target of an intra S-phase checkpoint activated when DNA synthesis is inhibited, ensuring that histone mRNA is rapidly destroyed when global DNA replication is blocked. Consistent with this, replication stress-induced histone mRNA decay is blocked in the presence of inhibitors of the PIKK family of checkpoint protein kinases, implicating PIKK family members in the regulation of this process.

Therefore, we aim to utilise a proteomic approach to to identify HBP/SLBP-associated proteins and post-translational status in order to elucidate the detailed mechanism of checkpoint activated HD. We have established isogenic cell lines stably expressing functional, tagged HBP/SLBP by using the Flp-In TM T-Rex TM Expression system. Our results indicate that isogenic Flp-In HeLa cell lines inducibly expressing tagged forms of SLBP under the control of a doxycycline promoter are a useful model system for the molecular analysis of SLBP function during replication stress.


شاهد الفيديو: Два теста ДНК решат судьбу Анны! Тайны ДНК 2021 Выпуск 1 от (كانون الثاني 2022).