معلومة

18: تنظيم النسخ بعد البدء - علم الأحياء


على الرغم من أن تنظيم بدء النسخ يبدو أنه عامل مهيمن في التحكم في التعبير عن العديد من الجينات ، فإن أهمية التنظيم بعد البدء أصبحت موضع تقدير بشكل أفضل في عدد متزايد ومتنوع من الأنظمة. الأنظمة الكلاسيكية التي تم فيها استكشاف هذه المشكلات هي أنتيتنت في ملتهمة العاثية l وفي التخفيف من النسخ في أوبيرونات التخليق الحيوي البكتيرية ، على وجه الخصوص trp أوبرون في بكتريا قولونية. على الرغم من أن بعض التفاصيل الآلية قد تكون خاصة بالبكتيريا ، لا سيما الحاجة إلى النسخ والترجمة المقترنين في trpنظام التوهين ، تظهر ظاهرة التنظيم بعد البدء في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية ، بدءًا من البكتيريا إلى البشر. تمت مناقشة بعض من هذا العمل في الأقسام الخاصة باستطالة النسخ في الفصل الثاني من الجزء الثالث.

مقدمة

كلا النظامين اللذين تمت مناقشتهما في هذا الفصل يتحكمان في وتيرة إنهاء النسخ. يمكن أن يمنع مضاد الإنقراض في العاثية l من بوليميريز الحمض النووي الريبي من التوقف عند النهايات المعتمدة على r ، مما يؤدي إلى نسخ الجينات المصب. يتحكم التوهين في مشغل trp أيضًا في التردد الذي يتوقف عنده RNA polymerase عند نقطة إنهاء مبكرة في المشغل ، وبالتالي ينظم نسخ الجينات المصب. على النقيض من النظام الموجود في l ، ينظم التوهين في trp الإنهاء عند عامل نهاية مستقل عن r.

Antitermination في الجراثيم l

فقط لمراجعة إحدى النقاط الواردة في الفصل الثالث بسرعة ، يحدث عدم التحديد في وقتين مختلفين في دورة الحياة. يسمح البروتين N بالنسخ بالقراءة في التحول من النسخ الفوري المبكر إلى النسخ المبكر ، ويسمح بروتين Q بنسخ الجينات المتأخرة بالقراءة.

الشكل 4.4.1

تذكر من الجزء الثالث من النص أن عوامل الإنهاء المعتمدة على r لا تحتوي على تسلسل محفوظ جيدًا أو بنية ثانوية. أيضًا ، يتتبع البروتين r على طول المناطق الخالية من البروتين من الحمض النووي الريبي حتى يصل إلى مجمع نسخ متوقف مؤقتًا في موقع يعتمد على r ، وعند هذه النقطة يمكن أن يتسبب نشاط هليكاز RNA في إنهاء وتفكك البوليميراز ونسخة من قالب DNA.

الشكل 4.4.2. عمل بروتين r عند إنهاء النسخ

المواقع الموجودة على الحمض النووي اللازمة لمقاومة الجراثيم في البكتيريا l. بندقمواقع (ن أوتمواقع ilization) لـ pN ، qutموقع pQ و بندقالمواقع موجودة داخل وحدة النسخ ، وليس لدى المروج وليس عند المُنهي.

  • الجوزيقع في منطقة 5 'غير المترجمة من نالجين و الجوزيقع في المنطقة غير المترجمة 3 من croالجين.
  • في كلتا الحالتين ، فإن بندقيسبق الموقع الفاصل الذي يعمل عنده pN.

الشكل 4.4.3. تقع مواقع الجوز داخل وحدات النسخ

على حد سواء الجوزو الجوز هي 17 نقطة أساس متتالية مع تناظر ثنائي.

5 'أGCCCTGAARAAGGGCA

TCGGACTTYTTCCCGتي 5 '

يتعرف البروتين pN على بندقالموقع ويرتبط ببوليميراز الحمض النووي الريبي أثناء نسخه عبر الموقع. يعتبر مجمع pN مع بوليميرات RNA عالي التجهيز ويتجاوز جهود r عند طرف الفصل.

بكتريا قولونية (المضيف) البروتينات اللازمة لعمل pN. تم عزل هذه الوظائف المضيفة التي عند حدوث طفرة تمنع عمل pN. NusA (مشفر بواسطة نو، ل ن شtization سالمجموعة التكميلية A) هي الأفضل تميزًا.

  1. يمكن أن تشكل جزءًا من مجمع النسخ
  2. تم اقتراح الارتباط ببوليميراز الحمض النووي الريبي الأساسي بعد فصله.
  3. يمكن أيضًا ربط pN.
  4. نموذج:

NusA يربط البلمرة الأساسية بعد أن ينفصل. حيث أن هذا المجمع ينسخ من خلال أ بندقالموقع ، يربط pN أيضًا. يمنع المركب a2bb'-NusA-pN الإنهاء المعتمد على r عند tR1, tR2، و tL1.

الشكل 4.4.4.

عدة أخرى لاتم تحديد الجينات. NusG هو متماثل بكتيري لعائلة من البروتينات المحفوظة المشاركة في الاستطالة. إنه متماثل مع الوحدة الفرعية الكبيرة لـ DSIF ، وهو عامل استطالة في الثدييات. DSIF هو العامل المحفز لحساسية DRB. تشير الدراسات الحالية إلى أنه له تأثير سلبي وإيجابي على الاستطالة. يحتوي على وحدتين فرعيتين ، واحدة من 160 كيلو دالتون التي تتماثل مع البروتين التنظيمي لنسخ الخميرة Spt5 ، وواحدة من 14 كيلو دالتون المتماثلة لبروتين الخميرة Spt4. اخر لاالجين يشفر بروتين الريبوسوم. هناك الكثير مما يجب تعلمه حول كل من الإنهاء ومنع الإنهاء. ال لايشير النمط الظاهري للطفرات في الجين الذي يشفر البروتين الريبوزومي إلى أن الترجمة مرتبطة أيضًا بهذه العملية.

مكونات الإشريكية القولونية TRP أوبرون

ال trpأوبرون يشفر الإنزيمات المطلوبة ل التخليق الحيوي للتربتوفان. بشكل أكثر تحديدًا ، جيناتها الخمسة (trpEDCBA) بتشفير خمس وحدات فرعية من البروتينات التي تحفز في المجموع خمس خطوات إنزيمية ، تحويل حمض الكوريزميك إلى التربتوفان. ومع ذلك ، هناك ليس 1: 1 المراسلات بين كسترون وإنزيم. على سبيل المثال، trpBو trpAترميز ، على التوالي ، الوحدات الفرعية b و a من سينثاز التربتوفان ، والتي تحفز استبدال الجلسرين -3 فوسفات من إندول -3-جلسرين-فوسفات مع سيرين لتشكيل التربتوفان ، مع جليسيرالديهيد -3 فوسفات كمنتج آخر

الشكل 4.4.5.

أ زعيم يفصل التسلسل المروج والمشغل عن الجين الهيكلي الأول للأوبون ، trpE. ان المخفف من النسخ يتبع الزعيم. كما سنرى بمزيد من التفصيل أدناه ، يتم تحديد كفاءة الإنهاء "المبكر" في هذا المخفف من خلال مدى ترجمة القائد ، والذي يتم تحديده بدوره من خلال توفر Trp-tRNAtrp. هذا جزء مهم من تنظيم المشغل. اثنين إنهاء من النسخ تتبع الجينات الهيكلية ، واحدة تعتمد على r والأخرى مستقلة عن r.

طرق التنظيم: قم بإيقاف تشغيل المشغل في وجود Trp

مشغل القامع: يتطلب ارتباط بروتين بموقع معين في وجود Trp لتقليل كفاءة بدء النسخ. توهين: استطالة (وإنهاء) النسخ بواسطة RNA polymerase مرتبط بتقدم الترجمة بواسطة الريبوسوم. في وجود Trp ، تؤدي الترجمة بواسطة الريبوسوم إلى إنهاء نسخ الجينات اللاحقة في المشغل.

القامع: apo-repressor و co-repressor (TRP)

ال apo- القامع يتم ترميزه بواسطة trpRفي مكان بعيد. إن apo-repressor هو homo-tetramer. إنه ذو صلة عالية بالمشغل فقط عندما يكون مرتبطًا بامتداد الأحماض الأمينية Trp ، والتي تعمل كمثبط مساعد. وبالتالي فإن المكثف النشط هو رباعي (apo- سابقًا) القامع في مركب مع Trp. القامع النشط يرتبط بالمشغل لمنع بدء النسخ. ال المشغل يتداخل مع المروج، بما في ذلك منطقة المروج -10. لها محور ثنائي من التماثل.

الشكل 4.4.6.

توهين

المخفف هو عبارة عن فاصل نسخي شرطي يستخدم لتنظيم التعبير عن عوامل التخليق الحيوي في البكتيريا. إنه المنبع من الجينات الهيكلية trpEDCBA وهو موقع إنهاء مستقل. تعتمد قدرته على إنهاء النسخ على قدرته على تكوين جذع الحمض النووي الريبي المزدوج الذي يميز مواقع الإنهاء المستقلة عن r.

الشكل 4.4.7

يتم تحديد جزء النصوص التي يتم قراءتها من خلال المخفف بواسطة [Trp-tRNAtrp]. تركيز tRNAs المشحونة هو مقياس لكمية Trp المتاحة لتخليق البروتين. إذا تم شحن معظم tRNAtrp ، فهناك وفرة من Trp ، ولا تحتاج الخلية إلى عمل المزيد. Low [Trp-tRNAtrp] يسمح بنسخ القراءة من خلال المخفف ، بحيث trpEDCBA يتم التعبير عنها وارتفاع [Trp-tRNAtrp] يؤدي إلى إنهاء النسخ عند المخفف.

يحدد [Trp-tRNAtrp] تقدم الريبوسومات لأنها تترجم ببتيد زعيم قصير. الببتيد القائد عبارة عن 14 ببتيد حمض أميني قصير مشفر بواسطة trpL. يوجد اثنان من الكودونات لـ Trp في القائد ، وسيتم تحديد تقدم الريبوسومات بعد أكواد Trp هذه من خلال توفر Trp-tRNAtrp. عندما يكون تركيز tryptophanyl-tRNA مرتفعًا ، فإن ترجمة trpسيكتمل القائد ، ولكن عندما يكون منخفضًا ، ستتوقف الترجمة عند أكواد التربتوفان.

يحدد مدى تقدم الريبوسومات الهياكل الثانوية التي تشكلت في القائد RNA. عندما يكون [Trp-tRNAtrp] مرتفعًا ، تترجم الريبوسومات إلى ما بعد أكواد Trp لإكمال زعيم التوليف للببتيد. هذا يسمح للحمض النووي الريبي الناشئ بتشكيل هيكل لفاصل r مستقل. وهكذا ينتهي النسخ قبل وصول بوليميراز الحمض النووي الريبي trpEDCBA. عندما يكون [Trp-tRNAtrp] منخفضًا ، تتوقف الريبوسومات عند أكواد Trp ، مما يمنع تكوين الهياكل الثانوية في الحمض النووي الريبي (RNA) اللازمة للانتهاء عند المخفف. وهكذا تستمر القراءة من خلال النسخ trpEDCBAويتم التعبير عن الأوبرا ، بحيث يتم إجراء المزيد من Trp.

الجدول 4.4.1: تم جدولة المكونات الأساسية للتنظيم عند المخفف الخاص بـ E. coli trpoperon أدناه.
[trp-tRNA]ترجمة trpLتشكلت الهياكل الثانوية في الحمض النووي الريبيالمخففمشغل
عاليمكتمل3-4 جذعإنهاء النسخإيقاف
قليلالأكشاك في TRP codons2-3 جذعالسماح بالقراءة من خلال النسختشغيل

الهياكل البديلة المزدوجة القاعدة في الرنا القائد. يمكن أن تشارك أربع مناطق من RNA القائد في تكوين البنية الثانوية ، ولا سيما السيقان المزدوجة القاعدة ؛ يشار إلى هذه ببساطة على أنها مناطق 1 و 2 و 3 و 4. ومن المحتمل ، يمكن أن يقترن 1 مع 2 ، ويمكن أن يقترن 2 مع 3 ، ويمكن أن يقترن 3 مع 4.

الشكل 4.4.8

الجذع المتكون من الاقتران بين 3 و 4 يصنع جذعًا غنيًا بـ G + C متبوعًا بـ U ، وهو ما يكفي لإنهاء النسخ المستقل عن r. عندما يكون [Trp-tRNAtrp] مرتفعًا ، تتشكل البنية المكونة من 3-4 أزواج قاعدية ، وينتهي النسخ عند المخفف. هذا يوقف تشغيل الأوبرا. يحول تكوين جذع مزدوج القاعدة بين المنطقتين 2 و 3 دون تكوين 3-4 فاصل ، وسيستمر النسخ في الجينات الهيكلية trpEDCBA. يؤدي هذا إلى تشغيل الأوبرا.

الشكل 4.4.9

الاختيار بين 2-3 جذع أو 3-4 جذع تمليه تقدم الريبوسوم. إذا كان بإمكان الريبوسوم أن يترجم ما بعد كودونات Trp (عندما يكون [Trp-tRNAtrp] مرتفعًا) ، فإنه سيصل إلى كودون إنهاء ترجمة طبيعي. عندما يكون الريبوسوم في هذا الموضع ، فإن المنطقة 2 من RNA القائد مغطاة بالريبوسوم ، لذلك لا يمكن أن يتشكل الجذع 2-3 ولكن يمكن أن يتشكل الجذع 3-4. هذا يولد البنية الثانوية اللازمة لإنهاء النسخ عند المخفف. في المقابل ، إذا توقف الريبوسوم عند كودونات Trp في القائد ، لأن [Trp-tRNAtrp] منخفض ، فإن المنطقة 2 من الرنا القائد لا يغطيها الريبوسوم. يمكنه بعد ذلك أن يتزاوج القاعدة مع المنطقة 3. وهذا يمنع تكوين الفاصل 3-4 ، ويمكن أن يستمر بوليميراز الحمض النووي الريبي في الاستطالة من خلال trpEDCBA.

تحليل الطفرات (أمثلة مختارة)

  • ترجمة trpLمطلوب للتنظيم عن طريق التوهين. تحول AUG لبدء ترجمة RNA القائد يمنع النسخ بعد المخفف. في حالة عدم وجود ترجمة ، يمكن أن تتكون كل من السيقان 1-2 و 3-4. الأخير 3-4 الجذعية هي فاصل.
  • مطلوب tRNAtrp المشحون للتنظيم. يؤدي تحور جينات tRNAtrp أو Trp-tRNAtrp synthetase إلى التعبير التأسيسي عن trpEDCBA. في هذه الطفرات ، ستتوقف الترجمة عند أكواد Trp بغض النظر عن [Trp] داخل الخلايا ، ولن يتشكل أي فاصل عند المخفف.
  • هياكل ثانوية محددة في trpهناك حاجة إلى زعيم الحمض النووي الريبي للتنظيم. على سبيل المثال الطفرات التي تقلل من عدد الأزواج الأساسية بين المناطق 3 و 4 ستقلل من مقدار إنهاء النسخ (أي زيادة التعبير عن الأوبون). الطفرات التعويضية التي تزيد من عدد الأزواج الأساسية بين 3 و 4 سوف تكبح الطفرات الأصلية.

يتطلب التوهين نسخًا وترجمة مقترنين

لا يتطلب أي بروتينات تنظيمية: شحن الحمض الريبي النووي النقال (tRNA) هو الإشارة التنظيمية. تحتاج إلى موقع إيقاف مؤقت للنسخ عند +90 للسماح للريبوسومات باللحاق ببوليميراز الحمض النووي الريبي وبالتالي التأثير على الهياكل الثانوية في الحمض النووي الريبي الوليد.

التوهين آلية شائعة لتنظيم عوامل التخليق الحيوي

يتم تنظيم العديد من العوامل التي تشفر الإنزيمات التي تحفز التخليق الحيوي للأحماض الأمينية عن طريق التوهين. في كل حالة ، يكون متعدد الببتيد القائد غنيًا بالحمض الأميني الذي هو نتاج المسار ، على سبيل المثال له ، phe ، leu ، خلال ، ilv.

قراءات إضافية

  • فريدمان ، د. والكونت ، د. (1995) النسخ المضادة للإنقراض: تم تحديث نموذج لامدا. علم الأحياء الدقيقة الجزيئي 18: 191-200.
  • Henkin ، T. (2000) إنهاء النسخ في البكتيريا. الآراء الحالية في علم الأحياء الدقيقة 3: 149-153.
  • Gusarov، I. and Nudler، E. (2001) التحكم في إنهاء النسخ الجوهري بواسطة N و NusA: الآلية الأساسية. الخلية 107: 437-449.

النسخ (علم الأحياء)

النسخ هي عملية نسخ جزء من الحمض النووي إلى الحمض النووي الريبي. يقال إن مقاطع الحمض النووي المنسوخة إلى جزيئات الحمض النووي الريبي التي يمكنها تشفير البروتينات تنتج الحمض النووي الريبي المرسال (مرنا). يتم نسخ أجزاء أخرى من DNA إلى جزيئات RNA تسمى RNAs غير المشفرة (ncRNAs). متوسط ​​على أنواع خلايا متعددة في نسيج معين ، تكون كمية الرنا المرسال أكثر من 10 أضعاف كمية الرنا الريباسي (على الرغم من أن أنواع الخلايا الفردية المعينة قد تتجاوز الرنا المرسال). [1] الغالبية العامة للـ mRNA في الخلايا صالحة على الرغم من أنه يمكن نسخ أقل من 2٪ من الجينوم البشري إلى mRNA (الجينوم البشري # الترميز مقابل الحمض النووي غير المشفر) ، في حين أن 80٪ على الأقل من الحمض النووي الجيني للثدييات يمكن أن يكون نشطًا نسخ (في نوع واحد أو أكثر من الخلايا) ، مع اعتبار غالبية 80 ٪ من هذه الخلايا ncRNA. [2]

كل من DNA و RNA عبارة عن أحماض نووية تستخدم أزواج قاعدية من النيوكليوتيدات كلغة تكميلية. أثناء النسخ ، تتم قراءة تسلسل الحمض النووي بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي ، والذي ينتج خيطًا مكملًا مضادًا للتوازي من الحمض النووي الريبي يسمى النسخة الأولية.

تتم عملية النسخ في الخطوات العامة التالية:

  1. إن بوليميراز الحمض النووي الريبي ، مع واحد أو أكثر من عوامل النسخ العامة ، يرتبط بالحمض النووي المحفز.
  2. يولد بوليميراز الحمض النووي الريبي فقاعة نسخ تفصل بين خيوط حلزون الحمض النووي. يتم ذلك عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين نيوكليوتيدات الحمض النووي التكميلية.
  3. يضيف بوليميراز الحمض النووي الريبي نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (وهي مكملة للنيوكليوتيدات في خيط DNA واحد).
  4. يتكون العمود الفقري للسكر والفوسفات من الحمض النووي الريبي بمساعدة من بوليميراز الحمض النووي الريبي لتشكيل حبلا الحمض النووي الريبي.
  5. تنكسر الروابط الهيدروجينية في لولب الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وتحرر خيط الرنا المركب حديثًا.
  6. إذا كانت الخلية تحتوي على نواة ، فقد تتم معالجة الحمض النووي الريبي بشكل أكبر. قد يشمل ذلك عديد الأدينيل ، والسد ، والربط.
  7. قد يبقى الحمض النووي الريبي في النواة أو يخرج إلى السيتوبلازم من خلال مجمع المسام النووي.

إذا تم نسخ امتداد DNA إلى جزيء RNA يشفر بروتينًا ، فإن RNA يسمى messenger RNA (mRNA) ، يعمل mRNA بدوره كقالب لتخليق البروتين من خلال الترجمة. يمكن نسخ امتدادات أخرى من الحمض النووي إلى RNAs صغيرة غير مشفرة مثل microRNA ، نقل RNA (tRNA) ، RNA صغير نووي (snoRNA) ، RNA نووي صغير (snRNA) ، أو جزيئات RNA إنزيمية تسمى الريبوزيمات [3] وكذلك أكبر الحمض النووي الريبي غير المشفر مثل الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA). بشكل عام ، يساعد الحمض النووي الريبي في تصنيع البروتينات وتنظيمها ومعالجتها ، وبالتالي يلعب دورًا أساسيًا في أداء الوظائف داخل الخلية.

في علم الفيروسات ، يمكن أيضًا استخدام مصطلح النسخ عند الإشارة إلى تخليق الرنا المرسال من جزيء الحمض النووي الريبي (أي ما يعادل تكرار الحمض النووي الريبي). على سبيل المثال ، قد يكون جينوم الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة (ssRNA -) ذي المعنى السلبي نموذجًا ل RNA أحادي الجديلة موجب الإحساس (ssRNA +) [ التوضيح المطلوب ]. هذا لأن خيط الحس الإيجابي يحتوي على معلومات التسلسل اللازمة لترجمة البروتينات الفيروسية اللازمة للتكاثر الفيروسي. يتم تحفيز هذه العملية بواسطة نسخة متماثلة من الحمض النووي الريبي الفيروسي. [4] [ التوضيح المطلوب ]


خلفية

النسخ الجيني هو عملية متعددة الخطوات تتكون من توظيف RNA polymerase II (Pol II) للمروجين وبدء النسخ والاستطالة والإنهاء. بالإضافة إلى إنتاج بوليمرات الحمض النووي الريبي (RNA) بناءً على قالب الحمض النووي ، فإن الإنزيم الهولندي Pol II ينظم أيضًا العديد من أحداث معالجة الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك تكوين 5-غطاء ، والربط ، وبولي أدينيل ، ونقل الحمض النووي الريبي [1-7].

في حين ركزت معظم الدراسات تاريخيًا على فهم كيفية تنظيم ربط المحفز وبدء النسخ ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن المراحل الإضافية من عملية النسخ منظمة أيضًا بإحكام وهي ضرورية لتنشيط الجينات. أثبتت هذه الدراسات أن ارتباط Pol II بمحفزات الجينات لا يكفي للنسخ المنتج. بدلاً من ذلك ، في غالبية الجينات ، يتم إيقاف Pol II جزئيًا من 20 إلى 60 nt من موقع بدء النسخ (TSS) ، وهناك حاجة إلى العديد من الخطوات المنظمة لكي يبتعد Pol II عن TSS ونسخ بقية الجين [8-15].

تم أيضًا ربط معدل حركة Pol II عبر أجسام الجينات بجوانب مختلفة من معالجة الحمض النووي الريبي النسخي المشترك. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤثر التغييرات في معدلات استطالة النسخ على نتيجة آلية الربط [7 ، 16 ، 17] ، وقد تبين أن الاستطالة البطيئة بواسطة Pol II تعزز إدراج exons ضعيف معين [7] لدعم هذه الفكرة ، Pol تم العثور على II تتراكم في exons [18-20]. وبالمثل ، فإن معدل الاستطالة بواسطة Pol II قد تم ربطه بتنظيم بديل متعدد الأدينيل [21] في الواقع ، يتراكم Pol II في مواقع polyadenylation [9].

تم التأكيد أيضًا على أهمية الخطوات اللاحقة لبدء النسخ النصي من خلال تأثير سوء تنظيم هذه الخطوات على قابلية الحياة الخلوية والكائن الحي. على سبيل المثال ، العديد من شركاء نقل الجينات MLL ، الذين يُعتقد أنهم يقودون سرطان الدم الحاد العدواني ، هم جزء من مجمع الاستطالة الفائق (SEC). تقوم بروتينات الانصهار MLL المرتبطة بسرطان الدم بإعادة تحديد موقع SEC إلى الجينات المستهدفة MLL ، متجاوزة التحكم الطبيعي في النسخ والتسبب في التعبير الشاذ عن تلك الجينات [22]. وبالمثل ، تم اقتراح c-Myc المفرط لزيادة التعبير الجيني عن طريق زيادة إطلاق Pol II المتوقف مؤقتًا وبالتالي تسهيل الاستطالة النشطة ، وبالتالي تخفيف قيود الحد من المعدل على نمو الخلايا السرطانية وانتشارها [23]. علاوة على ذلك ، تستخدم الفيروسات أو تعدل العمليات المتعلقة باستطالة النسخ لصالحها. على سبيل المثال ، يشتمل بروتين الإنفلونزا A NS1 على تسلسل شبيه بالهيستون يمكن أن يستهدف معقد الاستطالة PAF1 ، مما يتيح التعديل الانتقائي للتعبير الجيني للخلية المضيفة ويساهم في قمع الاستجابة المضادة للفيروسات [24].بالإضافة إلى ذلك ، أثناء الإصابة بفيروس HIV-1 النشط ، يقوم المتعامل الفيروسي بالنسخ (Tat) بتجنيد SEC إلى التكرار النهائي الطويل HIV-1 (LTR) لتنشيط التعبير عن الفيروس في الخلايا المضيفة [25-27]. وبالتالي ، يمكن أن يسهم التوضيح الأفضل لتنظيم استطالة النسخ في فهم الآليات الجزيئية للمرض ، وحتى اقتراح أساليب علاجية جديدة.

على الرغم من الروابط الموثقة بين معدلات الاستطالة والعديد من الوظائف المتعلقة بـ RNA ، تظل معدلات الاستطالة الفعلية داخل الخلايا قيد المناقشة ، حيث تتراوح القيم المبلغ عنها من 1 كيلو قاعدة في الدقيقة (Kb / min) إلى 6 Kb / min [28]. في معظم الحالات ، تم قياس معدلات الاستطالة لعدد قليل من الجينات في المرة الواحدة ، باستخدام تسلسل التشغيل العالمي (GRO-seq) ، وتمكنت من تحديد معدلات ما يقرب من 166 جينًا طويلًا تم تنظيمها استجابةً للعلاج القصير باستخدام الفسيولوجية. ، محرضات غير سامة [29]. نظرًا لأن معدلات استطالة الجينات الفردية يمكن تغييرها بطريقة تعتمد على التحفيز [29] ، فمن المهم قياس معدلات استطالة الجينات غير المحفزة من أجل استنباط فهم أكثر عمومية للعلاقة بين معدلات استطالة النسخ القاعدية والثبات حالة معالجة الحمض النووي الريبي والتعبير الجيني. علاوة على ذلك ، قد يوفر تقييم عدد كبير من الجينات معلومات أكثر تحديدًا عن العوامل التي تؤثر على معدلات استطالة النسخ. نحن هنا نصف طريقة تمكن من القياس بسهولة في وقت واحد ، في تجربة واحدة ، معدلات استطالة الحالة الثابتة لآلاف الجينات داخل الخلايا الحية.


التسلسلات التنظيمية القائمة على رابطة الدول المستقلة: المروجين والمعززات

كما ناقشنا سابقًا ، يتم تنظيم النسخ في البكتيريا من خلال ارتباط البروتينات بها رابطة الدول المستقلة-تسلسل الفعل (على سبيل المثال ، لاك عامل) يتحكم في نسخ الجينات المجاورة. مشابه رابطة الدول المستقلة- تسلسل الفعل ينظم التعبير عن الجينات حقيقية النواة. تم تحديد هذه التسلسلات في خلايا الثدييات إلى حد كبير عن طريق استخدام فحوصات نقل الجينات لدراسة نشاط المناطق التنظيمية المشتبه بها للجينات المستنسخة (الشكل 6.18). عادة ما يتم ربط التسلسلات التنظيمية لحقيقة النواة بجين مراسل يقوم بتشفير إنزيم يمكن اكتشافه بسهولة. يوفر التعبير عن الجين المراسل بعد نقله إلى الخلايا المستنبتة اختبارًا حساسًا لقدرة التسلسلات التنظيمية المستنسخة على النسخ المباشر. وبالتالي يمكن تحديد المناطق التنظيمية النشطة بيولوجيًا ، و في المختبر يمكن استخدام الطفرات لتحديد أدوار تسلسلات معينة داخل المنطقة.

الشكل 6.18

تحديد التسلسلات التنظيمية حقيقية النواة. يتم ربط التسلسل التنظيمي لجين حقيقي النوى المستنسخ بجين مراسل يقوم بترميز إنزيم يمكن اكتشافه بسهولة. يتم بعد ذلك إدخال البلازميد الناتج في الخلايا المستقبلة عن طريق تعداء الخلايا. (أكثر. )

تحتوي الجينات التي تم نسخها بواسطة RNA polymerase II على عنصرين محفزين أساسيين ، صندوق TATA وتسلسل Inr ، يعملان كمواقع ربط محددة لعوامل النسخ العامة. آخر رابطة الدول المستقلة-تسلسل الفعل بمثابة مواقع ربط لمجموعة واسعة من العوامل التنظيمية التي تتحكم في التعبير عن الجينات الفردية. هؤلاء رابطة الدول المستقلة-تتواجد التسلسلات التنظيمية للفاعل بشكل متكرر ، وإن لم يكن دائمًا ، في الجزء العلوي من مربع TATA. على سبيل المثال ، تم تحديد تسلسلين تنظيميين تم العثور عليهما في العديد من الجينات حقيقية النواة من خلال الدراسات التي أجريت على محفز جين فيروس الهربس البسيط الذي يشفر كيناز ثيميدين (الشكل 6.19). يقع كل من هذين التسلسلين ضمن 100 زوج أساسي في الجزء العلوي من مربع TATA: تسلسل إجماعيهم هو CCAAT و GGGCGG (يسمى صندوق GC). تم تحديد بروتينات معينة ترتبط بهذه التسلسلات وتحفز النسخ.

الشكل 6.19

محفز حقيقي النواة. يحتوي مروج جين ثيميدين كينيز لفيروس الهربس البسيط على ثلاثة عناصر تسلسلية في الجزء العلوي من صندوق TATA المطلوبة للنسخ الفعال: صندوق CCAAT وصناديق GC (تسلسل توافق الآراء GGGCGG). (أكثر. )

على عكس التنظيم البسيط نسبيًا لمربعات CCAAT و GC في محفز الهربس ثيميدين كيناز ، يتم التحكم في العديد من الجينات في خلايا الثدييات من خلال تسلسلات تنظيمية تقع على مسافة أبعد (أحيانًا أكثر من 10 كيلو قاعدة) من موقع بدء النسخ. تم تحديد هذه التسلسلات ، التي تسمى المحسّنات ، لأول مرة بواسطة والتر شافنر في عام 1981 أثناء دراسات محفز لفيروس آخر ، SV40 (الشكل 6.20). بالإضافة إلى صندوق TATA ومجموعة من ستة صناديق GC ، يلزم تكرار اثنين من 72 زوجًا أساسيًا يقعان بعيدًا عن المنبع من أجل النسخ الفعال من هذا المروج. تم العثور على هذه التسلسلات لتحفيز النسخ من المروجين الآخرين وكذلك من ذلك من SV40 ، ومن المدهش أن نشاطهم لم يعتمد على بعدهم ولا على توجههم فيما يتعلق بموقع بدء النسخ (الشكل 6.21). يمكن أن تحفز النسخ عند وضعها إما في أعلى التيار أو أسفله ، إما في الاتجاه الأمامي أو الخلفي.

الشكل 6.20

محسن SV40. يحتوي محفز SV40 للتعبير الجيني المبكر على صندوق TATA وستة صناديق GC مرتبة في ثلاث مجموعات من التسلسلات المتكررة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب النسخ الفعال مُحسِّنًا أوليًا يتكون من مكررين من 72 زوجًا أساسيًا (bp). (أكثر. )

الشكل 6.21

عمل معززات. بدون مُحسِّن ، يتم نسخ الجين عند مستوى قاعدي منخفض (أ). إضافة مُحسِّن ، E & # x02014 على سبيل المثال ، يكرر SV40 72 زوجًا أساسيًا & # x02014 يحفز النسخ. لا يكون المُحسِّن نشطًا فقط عند وضعه فقط (المزيد).

إن قدرة المعززات على العمل حتى عند فصلها بمسافات طويلة عن مواقع بدء النسخ تشير في البداية إلى أنها تعمل بآليات مختلفة عن تلك الخاصة بالمروجين. ومع ذلك ، فقد تبين أن هذا ليس هو الحال: المعززات ، مثل المحفزات ، تعمل عن طريق ربط عوامل النسخ التي تنظم بعد ذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي. هذا ممكن بسبب حلقات الحمض النووي ، والتي تسمح لعامل النسخ المرتبط بمحسن بعيد بالتفاعل مع بوليميريز الحمض النووي الريبي أو عوامل النسخ العامة في المروج (الشكل 6.22). وبالتالي ، يمكن لعوامل النسخ المرتبطة بالمُعزِّزات البعيدة أن تعمل بنفس الآليات مثل تلك المرتبطة بالمُعزِّزات ، لذلك لا يوجد فرق جوهري بين أفعال المُعزِّزات وتلك الخاصة بالمُعزِّزات. رابطة الدول المستقلة- عمل التسلسلات التنظيمية المجاورة لمواقع بدء النسخ. ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من التعرف على المعززات لأول مرة في خلايا الثدييات ، فقد تم العثور عليها لاحقًا في البكتيريا & # x02014 وهو مثال غير عادي حيث كانت دراسات حقيقيات النوى بمثابة نموذج لأنظمة بدائية النواة الأبسط.

الشكل 6.22

حلقات الحمض النووي. عوامل النسخ المرتبطة بالمعززات البعيدة قادرة على التفاعل مع عوامل النسخ العامة في المحفز لأن الحمض النووي المتداخل يمكن أن يشكل حلقات. لذلك لا يوجد فرق جوهري بين إجراء النسخ (المزيد).

يعد ارتباط البروتينات التنظيمية النسخية المحددة بالمُعزِّزات مسؤولاً عن التحكم في التعبير الجيني أثناء التطور والتمايز ، وكذلك أثناء استجابة الخلايا للهرمونات وعوامل النمو. يتحكم أحد أكثر معززات الثدييات التي تمت دراستها بدقة في نسخ جينات الغلوبولين المناعي في الخلايا الليمفاوية البائية. أثبتت تجارب نقل الجينات أن مُحسِّن الغلوبولين المناعي نشط في الخلايا الليمفاوية ، ولكن ليس في أنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي ، فإن هذا التسلسل التنظيمي مسؤول جزئيًا على الأقل عن التعبير الخاص بالأنسجة عن جينات الغلوبولين المناعي في نوع الخلية المتمايزة المناسبة.

يتمثل أحد الجوانب المهمة للمُحسِّنات في أنها تحتوي عادةً على عناصر تسلسل وظيفي متعددة تربط بروتينات تنظيمية نسخية مختلفة. تعمل هذه البروتينات معًا لتنظيم التعبير الجيني. على سبيل المثال ، يمتد مُحسِّن الجلوبيولين المناعي ثقيل السلسلة على ما يقرب من 200 زوج أساسي ويحتوي على تسعة عناصر تسلسل مميزة على الأقل تعمل كمواقع ربط البروتين (الشكل 6.23). يؤدي تحور أي من هذه التسلسلات إلى تقليل نشاط المُحسِّن ولكنه لا يلغيه ، مما يشير إلى أن وظائف البروتينات الفردية التي ترتبط بالمُحسِّن تكون زائدة جزئيًا على الأقل. تحفز العديد من عناصر التسلسل الفردية لمُحسِّن الغلوبولين المناعي في حد ذاتها النسخ في الخلايا غير اللمفاوية. وبالتالي فإن النشاط المقيد للمُحسِّن السليم في الخلايا الليمفاوية البائية لا ينتج عن الوظيفة الخاصة بالأنسجة لكل من مكوناته. بدلاً من ذلك ، ينتج التعبير الخاص بالأنسجة عن مجموعة عناصر التسلسل الفردية التي تشكل المُحسِّن الكامل. هذه العناصر تشمل بعض رابطة الدول المستقلة-التمثيل المتواليات التنظيمية التي تربط المنشطات النسخية التي يتم التعبير عنها تحديدًا في الخلايا الليمفاوية B ، بالإضافة إلى التسلسلات التنظيمية الأخرى التي تربط المثبطات في الخلايا غير اللمفاوية. وبالتالي ، يحتوي مُحسِّن الغلوبولين المناعي على عناصر تنظيمية سلبية تمنع النسخ في أنواع الخلايا غير المناسبة ، فضلاً عن العناصر التنظيمية الإيجابية التي تنشط النسخ في الخلايا الليمفاوية البائية. يكون النشاط الكلي للمعزز أكبر من مجموع أجزائه ، مما يعكس العمل المشترك للبروتينات المرتبطة بكل عنصر من عناصر التسلسل الفردية الخاصة به.

الشكل 6.23

محسن الغلوبولين المناعي. يمتد مُحسِّن الغلوبولين المناعي ثقيل السلسلة على حوالي 200 قاعدة ويحتوي على تسعة عناصر تسلسلية وظيفية (E ، & # x003bcE1-5 ، & # x003c0 ، & # x003bcB ، و OCT) ، والتي تحفز معًا النسخ في الخلايا اللمفاوية البائية.


نقاش

لقد سبق أن أظهرنا ذلك CLN3 يتم تنظيم مستويات mRNA بواسطة مصدر الكربون وهذا تحريض الجلوكوز CLN3 لا يعتمد النسخ على النمو الخلوي أو التقدم خلال دورة الخلية (19). باستخدام CLN3 بنيات اندماج المروج والمراسل ، لقد حددنا منطقة بين المواضع & # x02212762 و & # x02212414 في CLN3 المروج الذي يمكن أن يمنح تنظيم الجلوكوز لجين مراسل غير متجانسة. هذه المنطقة داخل CLN3 يحتوي المروج على خمس نسخ ، أربع نسخ دقيقة وواحدة جزئية ، من التسلسل AAGAAAAA. قليل النوكليوتيدات الصغيرة التي تقطعت بهم السبل والتي تحتوي على هذه التسلسلات المتكررة قادرة على دفع التعبير المعتمد على الجلوكوز عن الجين المراسل. تقلل الطفرات في هذه العناصر بشكل كبير من الاستقراء النسخي لكل من أ URA3 مراسل و CLN3 الجين عن طريق الجلوكوز. تُظهر فحوصات تحول التنقل ارتباطًا محددًا للبروتينات من مستخلصات الخميرة إلى شظايا الحمض النووي التي تحتوي على التكرارات. يمكن أن يتنافس الارتباط بالبروتين مع قليل النوكليوتيد المسمى مع فائض مولاري من قليل النوكليوتيدات الذي يحتوي على التسلسلات المتكررة أعلاه ، ولكن طفرة G & # x02019 المركزية داخل التكرارات تقلل من قدرة الحمض النووي غير المسمى على التنافس. تشير هذه النتائج إلى أهمية العناصر المتكررة لكل من تحريض النسخ وتفاعلات بروتين DNA. كشف النشاف الجنوبي الغربي عن بروتين بحجم ظاهر 69 كيلو دالتون يرتبط بشكل خاص بهذه التسلسلات بطريقة تعتمد على التكرارات السليمة ، بالإضافة إلى بروتين أصغر يرتبط بطريقة لا تتأثر بالتغيرات في التكرارات.

لم نعثر على أي دليل يشير إلى أن الجلوكوز ينظم ارتباط البروتينات بعناصر CLN3 المروج الذي يمنح استجابة الجلوكوز. هذا يشير إلى أن تنظيم الجلوكوز CLN3 تتضمن عملية أكثر تعقيدًا من الارتباط المنظم البسيط للمعامل ، أو البروتين المثبط ، بـ CLN3 المروجين. خطوة مهمة في تعلم كيفية تأثير الجلوكوز CLN3 سيكون التعبير هو تحديد البروتين (البروتينات) الذي يرتبط بالعناصر المستجيبة للجلوكوز في CLN3 المروجين. سيكون من المثير للاهتمام معرفة كيف تتأثر هذه البروتينات بالجلوكوز. سؤال مهم آخر هو ما إذا كانت هذه العوامل خاصة CLN3 التعبير أو جزء من مسار مشترك ينسق التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات استجابة للجلوكوز. في هذا الصدد ، أسفر البحث في قاعدة البيانات عن عدد قليل فقط من مروجي الخميرة الذين يحملون هذه العناصر المتكررة. لم تندرج هذه الجينات في أي مجموعة واضحة من حيث الوظيفة ، ولا يبدو أنها جميعًا منظمة نسبيًا بواسطة الجلوكوز. لذلك ، لا يمكننا القول ما إذا كانت الميزات التي تنظم نسخ CLN3 مهمة في تنظيم الجينات الأخرى.

تحوير خمس قواعد فقط ، محصورة في A2GA5 يتكرر داخل CLN3 المروج ، ينتج الخلايا التي لا تزيد من مستويات Cln3 بشكل صحيح استجابة للجلوكوز. من الواضح أن استجابة الانخفاض هذه لها أهمية وظيفية ، لأنه في وسط الجلوكوز ، تصبح هذه الخلايا تقريبًا ضعف حجم عناصر التحكم التي تعبر CLN3 من المروج من النوع البري. لم نتمكن من اكتشاف كمية ملحوظة من بروتين Cln3 في خلايا TKL1 ، ومع ذلك ، نعتقد أن بروتين Cln3 يتم التعبير عنه في هذه الخلايا ، لأنها تبدو أصغر من الخلايا ذات الخلايا. CLN3 تم حذفه بالكامل. أنتج البلازميد أحادي النسخة مستويات بروتين Cln3 التي كانت ، في دراستنا ، قريبة من حد الكشف. نقترح أن تحتوي خلايا TKL1 على مستوى معين من بروتين Cln3 الوظيفي منخفض جدًا بحيث لا يعطي إشارة في تجاربنا. في حين أنه من الواضح أن هذه العناصر تساهم في الاستجابة للجلوكوز ، فمن الواضح بنفس القدر أن هذه العناصر وحدها لا تفسر ، في حد ذاتها ، تقصير دورة الخلية التي ينتجها الجلوكوز. بادئ ذي بدء ، بينما طفرة من خمسة أ2GA5 التكرار يقلل من قدرة الجلوكوز على الزيادة CLN3 مستويات mRNA ، هذا لم يلغي الاستجابة تمامًا. قد يكون هذا بسبب أن العناصر أو الآليات الأخرى التي لا تتضمن هذه التسلسلات المتكررة تظل قادرة على الزيادة CLN3 مستويات النسخ استجابة للجلوكوز. من الممكن أيضًا أن تكون الاستجابة المتبقية ناتجة عن وجود نسخ إضافية غير كاملة من التسلسل المتكرر. بينما ركزنا على 8-bp A.2GA5 التسلسل ، هناك ما مجموعه 13 نسخة من تسلسل أقصر 6-bp AAGAAA ضمن 1000 قاعدة أعلى المنبع من CLN3 تسلسل الترميز. من الممكن أن تساهم هذه أيضًا في استجابة الجلوكوز. ثانيًا ، يتم تنظيم مستويات بروتين Cln3 على مجموعة متنوعة من المستويات بالإضافة إلى النسخ استجابة لإشارات المغذيات. تتضمن هذه الآليات تنظيمًا لما بعد النسخ عن طريق الوسط الغني (20) ، ومسار AMP الدوري الدائري (10) ، ومعدلات تخليق البروتين (10) ، والحد من النيتروجين (8). وأخيرا، فإن CLN3 يُعتقد أن الجين يعمل في مسار زائدة عن الحاجة ، في هذا الحذف لـ CLN3 تكون مميتة فقط مع فقدان الجينات الأخرى ، وأبرزها ، BCK2 (4 ، 7). يبدو من المحتمل أن العناصر الغذائية ستنظم مكونات دورة الخلية الأخرى بالإضافة إلى CLN3.

يبدو أن أقرب متماثلات الثدييات إلى Cln3 هي الأعاصير من النوع D. كل من الأعاصير من النوع D و CLN3 لها أوجه تشابه في التعبير ، كونها أقل تأثرًا بموضع دورة الخلية من الأعاصير الأخرى ، ويبدو أن كلا النوعين من cyclin يعملان في عملية إنهاء G1. تعمل الأعاصير D على ربط الإشارات الانقسامية من البيئة الخلوية إلى عملية الخروج من G1 (22). كما هو الحال مع الأعاصير D ، يبدو أن مستويات Cln3 تنظمها إشارات بيئية ، في هذه الحالة تنشأ من موارد المغذيات. تنظيم النسخ CLN3 التي نصفها يبدو أنها ليست سوى واحدة من طبقات التحكم المتعددة التي تسمح لخلايا الخميرة بتعديل G1 الطول.


العمل مع علم الوراثة الجزيئية

يغطي هذا الكتاب المدرسي عبر الإنترنت موضوعات رئيسية في علم الوراثة الجزيئي في نهج قائم على المشكلات. لقد نشأ عن تدريس مقرر دراسي للطلاب الجامعيين وطلاب الدراسات العليا في جامعة ولاية بنسلفانيا (BMB400).

حقوق النشر محفوظة للمؤلف روس سي هارديسون. أي شخص حر في قراءة واستخدام هذه المعلومات لأي غرض باستثناء الربح. أجعله متاحًا مجانًا ، لذا احتفظ به مجانًا. على سبيل المثال ، إذا كنت تقوم بتدريس فصل وترغب في توجيه الطلاب إليه ، فيرجى القيام بذلك. إذا كنت ترغب في استخدام هذه المادة لتعلم بعض علم الوراثة الجزيئية ، يرجى القيام بذلك. إذا كنت تريد استخدام بعض الأشكال في تقرير ، فافعل ذلك ، فقط قم بإدراج هذه الصفحة كمصدرك. إذا كنت تريد أن تأخذ أيًا من هذه المواد أو كلها وتنشرها ككتاب من أجل ربحك - فلا تفعل!

كانت المادة سارية اعتبارًا من خريف عام 2002. معظم المواد "مستقرة" نسبيًا ، لذا نأمل أن تكون مفيدة لبعض الوقت في المستقبل. لا أنوي تحديثه كثيرًا ، على كل حال. ومع ذلك ، نرحب دائمًا بالتعليقات ، وقد تلهمني لتعديلها أكثر.

أضاف العديد من المحاضرين الضيوف مواد مهمة إلى هذه الدورة التدريبية والكتاب. على وجه الخصوص ، أشكر تريسي نيكسون (قسم BMB ، PSU) لمساهماته في الفصل 16 وجيري وركمان (سابقًا في BMB في PSU ، والآن في Stowers Institute) لمساهماته في الفصل 20. الكتب والمقالات والمواقع الإلكترونية. لقد حاولت الاستشهاد بكل هذه المصادر ، أرجوك سامحني إذا كنت قد أغفلت أي منها.

يمكنك الوصول إلى نسختي html و pdf من الفصول. ملفات PDF هي تمثيلات أكثر دقة ، ولكن يتم توفير لغة تأشير النص الفائق للراحة. تم إنشاء المادة الأصلية في Microsoft Word ، ويتم إنشاء html بواسطة أداة التحويل "Word to html" داخل Word. أعلم أن بعض الأشياء (مثل الأسهم والأسس وحتى مواضع الأشكال فيما يتعلق بالنص) لا يتم تقديمها بدقة ، لذا احذر من هذه المشكلة. تم عمل بعض الصور منذ سنوات في MacDraw (ملفات pict) ، ولم يتم عرضها جيدًا. يتم رسم عدد صغير يدويًا ومسحها ضوئيًا بحيث يصعب قراءته. ومع ذلك ، يجب أن تكون معظم الأرقام مقروءة ، لا سيما في ملفات PDF.


التحميل الان!

لقد سهلنا عليك العثور على كتب إلكترونية بتنسيق PDF دون أي حفر. ومن خلال الوصول إلى كتبنا الإلكترونية عبر الإنترنت أو عن طريق تخزينها على جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، لديك إجابات مناسبة مع Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf. للبدء في العثور على ملف Campbell Biology Chapter 18 Test Pdf ، فأنت محق في العثور على موقعنا الإلكتروني الذي يحتوي على مجموعة شاملة من الأدلة المدرجة.
مكتبتنا هي الأكبر من بين هذه المكتبات التي تحتوي على مئات الآلاف من المنتجات المختلفة الممثلة.

أخيرًا ، حصلت على هذا الكتاب الإلكتروني ، شكرًا على كل اختبار Pdf للفصل 18 في علم الأحياء من كامبل الذي يمكنني الحصول عليه الآن!

لم أكن أعتقد أن هذا سيعمل ، أظهر لي أفضل أصدقائي هذا الموقع ، وهو يعمل! أحصل على الكتاب الإلكتروني المطلوب

wtf هذا الكتاب الاليكترونى الرائع مجانا ؟!

أصدقائي غاضبون جدًا لدرجة أنهم لا يعرفون كيف أمتلك كل الكتب الإلكترونية عالية الجودة التي لا يعرفون عنها!

من السهل جدًا الحصول على كتب إلكترونية عالية الجودة)

الكثير من المواقع المزيفة. هذا هو أول واحد نجح! تشكرات

wtffff أنا لا أفهم هذا!

ما عليك سوى اختيار النقر ثم زر التنزيل ، وإكمال العرض لبدء تنزيل الكتاب الإلكتروني. إذا كان هناك استبيان يستغرق 5 دقائق فقط ، فجرب أي استطلاع يناسبك.


نتائج

العلامات اللاجينية المرتبطة بالمُحسِّن في Ikzf1 DHS الخاصة بالليمفاوية

رسم خرائط مجموعات خاصة باللمفويد من DHSs في Ikzf1 حدد الموضع سابقًا 10 مناطق تنظيمية مفترضة 16 (الشكل 1).تم تحديد غالبية هذه المواقع أيضًا مؤخرًا عن طريق رسم خرائط DHS على مستوى الجينوم في الخلايا الزعترية والخلايا الطحالية والخلايا B التي تم إنشاؤها بواسطة مشروع ENCODE 20 (الجدولان التكميليان رقم 1 في الجدول 6 و 8). على مقربة من مواقع المسح الديموغرافي والصحي هذه كانت مناطق حفظ واسعة النطاق بين الفأر والإنسان Ikzf1 (IKZF1). تم تحديد سبعة مناطق محفوظة intronic (p و D و E و F و G و H و I) و 1 في المنبع (J) ، و 5 (DH) كانت موجودة داخل ∼40-kb intron بين exons 3 و 4 (& gt86 ٪ الجدول 1 الشكل 1).

الترسيم فوق الجيني Ikzf1 المناطق التنظيمية. يتم عرض موقع 10 مجموعات DHS المحددة اللمفاوية 16 والمناطق غير المشفرة مع الحفاظ على التسلسل البشري للفأر على نطاق واسع في Ikzf1 المكان. تتم الإشارة إلى مجموعات DHS و DHS الفردية بواسطة أشرطة عمودية قصيرة أو أشرطة حمراء. على ال Ikzf1 locus ، الإكسونات غير المترجمة 1 أ و 1 ب المرتبطة بأنشطة المروج المتميزة يشار إليها على أنها مستطيلات غير مملوءة والإكسونات السبعة المترجمة من 2 إلى 8 كمستطيلات صلبة. قمم التخصيب لتعديلات هيستون H3 (H3K4me1 ، me2 ، me3 ، H3K9 / 14Ac ، و H3K36me3) ولأشكال بدء RNA Pol II (pII) (8WG16) والاستطالة (S5 ، S2) في Ikzf1 يتم عرض الموضع بواسطة عارض الجينوم التكاملي (IGV) 2.1 باستخدام قاعدة بيانات جينوم الماوس mm9. تم استنتاج قمم التخصيب لـ H3K27Ac و p300 من بيانات الترميز (الجدول التكميلي 8). 20

ترسيم فوق جيني Ikzf1 المناطق التنظيمية. يتم عرض موقع 10 مجموعات DHS المحددة اللمفاوية 16 والمناطق غير المشفرة مع الحفاظ على التسلسل البشري للفأر على نطاق واسع في Ikzf1 المكان. تتم الإشارة إلى مجموعات DHS و DHS الفردية بواسطة أشرطة عمودية قصيرة أو أشرطة حمراء. على ال Ikzf1 locus ، الإكسونات غير المترجمة 1 أ و 1 ب المرتبطة بأنشطة المروج المتميزة يشار إليها على أنها مستطيلات غير مملوءة والإكسونات السبعة المترجمة من 2 إلى 8 كمستطيلات صلبة. قمم التخصيب لتعديلات هيستون H3 (H3K4me1 ، me2 ، me3 ، H3K9 / 14Ac ، و H3K36me3) ولأشكال بدء RNA Pol II (pII) (8WG16) والاستطالة (S5 ، S2) في Ikzf1 يتم عرض الموضع بواسطة عارض الجينوم التكاملي (IGV) 2.1 باستخدام قاعدة بيانات جينوم الماوس mm9. تم استنتاج قمم التخصيب لـ H3K27Ac و p300 من بيانات الترميز (الجدول التكميلي 8). 20

لاكتساب نظرة ثاقبة على أنواع العناصر التنظيمية المرتبطة بـ Ikzf1 تم فحص بيئة الكروماتين المباشرة المحفوظة بواسطة ChIP من تعديلات هيستون إلى جانب التسلسل عالي الإنتاجية (ChIP-Seq) في الخلايا التوتية. 17 قمنا أولاً بفحص حالة المثيلة لـ H3K4 التي ترتبط بكل من المروجين والمعززات النشطة نسبيًا والنسخة. عرض 23 H3K4me1 توزيعًا واسعًا على الكل Ikzf1 المكان. في المقابل ، تم إثراء H3K4me2 و H3K4me3 على وجه التحديد في Ikzf1 المواقع التنظيمية المفترضة وليس في جميع أنحاء الموقع (J ، p ، D ، E ، F ، G ، H ، I). ومع ذلك ، فقد اختلفت توزيعاتها ، حيث تم إثراء H3K4me3 بدرجة عالية عند المروجين واستنفاد نسبيًا عند 5 ′ و intronic DHS ، بينما تم توزيع H3K4me2 بالتساوي في جميع هذه المواقع. على غرار H3K4me3 ، أظهر H3K9Ac إثراءًا قويًا للمروج وإثراءًا أقل في مواقع تنظيمية أخرى. على غرار H3K4me2 ، أظهرت علامات المُحسِّن p300 و H3K27Ac 20 توزيعًا غير محفز.

معززات نشطة نسبيًا في Ikzf1 تم تقييم الموضع بشكل أكبر من خلال فحص توزيع أشكال ما قبل الاستطالة والاستطالة لـ RNApII. 24 تم توزيع الأشكال الفسفورية S5 و S2 لبوليميراز RNA ، بالإضافة إلى علامة الاستطالة النسخية H3K36me3 ، في جميع أنحاء Ikzf1 موضع (الشكل 1). على النقيض من ذلك ، تم اكتشاف الشكل غير الفسفوري لبوليميراز الحمض النووي الريبي (المعترف به بواسطة الجسم المضاد 8WG16) الذي يمثل مرحلة ما قبل بدء النسخ والمعززات النشطة فقط في Ikzf1 المجموعات التنظيمية.

وبالتالي ، فإن التوزيع التفاضلي لرموز هيستون ومعدلات الكروماتين وعوامل النسخ في العديد من Ikzf1 تدعم مجموعات DHS المحفوظة دورها المحتمل كمحسّنات نسخية في تنظيم تعبير Ikaros أثناء التطوير.

الخصائص اللاجينية والنسخية لـ Ikzf1 معززات

المفترض Ikzf1 تم اختبار معززات لقدرتها على تعزيز نسخ مراسل GFP من الرئيسي Ikzf1 (B-p) المروج (الشكلان 1 و 2 أ). تم إنشاء 16 كاسيت مراسل حيث تم الحفاظ على اتجاه المحسن المفترض بالنسبة إلى المروج ، كما هو الحال في Ikzf1 المكان. لكل كاسيت مراسل ، تم إنشاء العديد من خطوط الماوس المعدلة وراثيًا واختبارها لتعبير GFP في كريات الدم البيضاء في الدم المحيطي (PBLs). يتم توفير عدد الأسطر لكل مراسل ورقم نسخة التحوير (الأشكال التكميلية 2 و 3 الجدول التكميلي 1).

أنشطة المحسن المرتبطة بـ Ikzf1 المواقع التنظيمية. (أ) تظهر الرسوم التخطيطية لبنى المراسل المستخدمة في هذه الدراسة على اليسار. يتم عرض عدد المؤسسين الذين عبروا عن GFP على إجمالي عدد المؤسسين الذين تم الحصول عليهم لكل مراسل. الدلالة الإحصائية للفرق (الزيادة) في سطور مؤسس GFP المعبر عنها مقارنة بالأب B-ص- تم توفير خطوط GFP بواسطة تحليل χ 2 ويظهر على شكل a ص القيمة. (ب) يتم وصف النسبة المئوية لـ GFP + PBLs التي تم تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي لكل خط مؤسس كدوائر. تم حساب متوسط ​​النسبة المئوية لـ GFP + PBLs لكل مراسل معدل وراثيًا إما لجميع المؤسسين الذين يعبرون عن GFP (الشريط الأسود) أو جميع المؤسسين (الشريط الرمادي). (ج) تم تقدير MFI لـ GFP + PBLs لكل خط مؤسس (الماس الرمادي) لكل مراسل معدّل وراثيًا كما هو موضح في اللوحة B.

أنشطة المحسن المرتبطة بـ Ikzf1 المواقع التنظيمية. (أ) تظهر الرسوم التخطيطية لبنى المراسل المستخدمة في هذه الدراسة على اليسار. يتم عرض عدد المؤسسين الذين عبروا عن GFP على إجمالي عدد المؤسسين الذين تم الحصول عليهم لكل مراسل. الدلالة الإحصائية للفرق (الزيادة) في سطور التأسيس المعبر عنها لـ GFP مقارنة بالأبوين B-ص- تم توفير خطوط GFP بواسطة تحليل χ 2 ويظهر على شكل a ص القيمة. (ب) يتم وصف النسبة المئوية لـ GFP + PBLs التي تم تقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي لكل خط مؤسس كدوائر. تم حساب متوسط ​​النسبة المئوية لـ GFP + PBLs لكل مراسل معدل وراثيًا إما لجميع المؤسسين الذين يعبرون عن GFP (الشريط الأسود) أو جميع المؤسسين (الشريط الرمادي). (ج) تم تقدير MFI لـ GFP + PBLs لكل خط مؤسس (الماس الرمادي) لكل مراسل معدّل وراثيًا كما هو موضح في اللوحة B.

نشاط Ikzf1 تم تقييم المناطق التنظيمية في مواجهة إسكات الكروماتين المحلي وتعزيز النسخ من خلال تقدير عدد GFP التي تعبر عن الخطوط المعدلة وراثيًا (التعبير gt1 ٪ في PBLs) ، والتعبير في مجموعات فرعية PBL ، ومتوسط ​​مستوى تعبير المراسل. عرضت غالبية الخطوط المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها بواسطة هؤلاء المراسلين الذين يحركهم المحسن تعبير GFP في PBL (الشكل 2A-B). كانت هذه زيادة كبيرة (ص & lt .05) على جزء صغير من المؤسسين الذين يعبرون عن GFP الذين تم الحصول عليهم من خلال المراسل الأبوي الذي يحركه المروج فقط (الشكل 2 أ ب-ص-GFP 11٪). 16 بين Ikzf1 أظهرت المناطق التنظيمية ، J ، D ، و E أقوى نشاط مُحسِّن ، داعمًا للتعبير في 88٪ إلى 93٪ من الخطوط المعدلة وراثيًا ، بينما كانت F و I و H أضعف ، ودعم التعبير في 53٪ إلى 75٪ من الخطوط المعدلة وراثيًا (الشكل 2A الأشكال التكميلية 2 و 3 الجدول التكميلي 1).

كان تعبير المراسل في PBLs شديد التلوين (الشكل 2 ب) ، مما يشير إلى أنه على الرغم من أن Ikzf1 يمكن للمُحسّنات في البداية أن يكون الكروماتين المضاد للتقييد في موقع تكامل المراسل ، ولم يتمكنوا من الحفاظ على كروماتين متساهل نسبيًا داخل Ikzf1-تعبير عن مجموعات فرعية PBL. على سبيل المثال ، على الرغم من أن B-ص-مراسل GFP-D تم التعبير عنه في 93٪ من خطوطه المعدلة وراثيًا (ص & lt 5 × 10 7) ، في المتوسط ​​، تم اكتشاف التعبير في 42 ٪ فقط من PBLs. من ناحية أخرى ، على الرغم من أن B-صتم التعبير عن مراسل -GFP-H في جزء أصغر (53٪) من خطوط المؤسس ، وشوهد التعبير في جزء أكبر (48٪) من PBLs ، مما يشير إلى إمكانات أقوى في الحفاظ على كروماتين متساهل نسبيًا (الشكل 2 ب).

ال Ikzf1 تم تقييم معززات كذلك عن طريق قياس مستوى التعبير المراسل. والجدير بالذكر أن متوسط ​​شدة التألق (MFI) للخلايا التي تعبر عن GFP من خطوط مراسل محسن D تجاوزت تلك الخاصة بجميع المراسلين الآخرين ، سواء تم قياسها من جميع الخطوط المعدلة وراثيًا أو من التعبير عن الخطوط المعدلة وراثيًا (الشكل 2C ، يظهر المتوسط ​​كخط رمادي أو أسود ، على التوالى). الاختلاف الكبير في التعبير الذي يوفره متوسط ​​MFI لجميع الخطوط المعدلة وراثيًا مقابل التعبير عن الخطوط المعدلة وراثيًا لـ F و H وأنا اقترحت أن هذه المعززات كانت فعالة في تحفيز النسخ ولكن فقط في الكروماتين المتساهل. في المقابل ، على الرغم من أن مُحسِّن J المنبع كان ضعيفًا في تحفيز النسخ ، إلا أنه كان فعالًا للغاية في مواجهة الكروماتين القمعي ، مما يوفر عددًا أكبر من الخطوط المعدلة وراثيًا منخفضة التعبير.

وهكذا ، كشف تحليل المراسلين المعدلين وراثيا عن وجود نوعين من رابطة الدول المستقلة-تفاعل العناصر المرتبطة Ikzf1 معززات (الجدول التكميلي 1). واجه أحد أنواع الكروماتين المقيد وتنوع تأثير الموضع (PEV) كما تم توثيقه من خلال زيادة في كل من عدد المؤسسين المعبر عنهم و PBLs المعبر عن المراسلين. من المحتمل أن تدعم هذه العناصر توظيف العوامل اللاجينية التي تعزز حالة الكروماتين المتساهلة نسبيًا. النوع الثاني كان فعالا في تحفيز النسخ في الكروماتين المتساهل ، بما يتماشى مع نشاط المحسن الكلاسيكي الذي يعمل عن طريق تعزيز مرحلة البدء أو الاستطالة لدورة RNApII.

خصوصية نوع خلية Ikzf1 معززات

ال Ikzf1 معززات تم تقييمها بعد ذلك لآثارها الخاصة بنوع الخلية على تعبير المراسل (الشكل 3A-B التكميلية الأرقام 2 و 3 و 5). تم فحص نمط التعبير عن خطوطهم المعدلة وراثيا للانحرافات عن ملف تعريف "النخاع النخاعي العالي B / منخفض T / المتوسط" المقدم من قبل المراسل الأبوي الذي يحركه المروج للتو والذي تم اختبار هذه المعززات عليه (الشكل 3 أ-ب ب-ص-GFP). تم فحص 16 PBLs من كل خط مؤسس لتعبير GFP في الخلايا B (B220 +) ، والخلايا التائية (TCRβ +) ، والخلايا النخاعية (Mac-1 +) في الدم المحيطي عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 3A الأشكال التكميلية 2 ، 3 ، و 5).

خصوصية نوع خلية Ikzf1 معززات. (أ) تظهر الرسوم التخطيطية لبنى المراسل المستخدمة في هذه الدراسة على اليسار. يتم تلخيص أنماط تعبير GFP الخاص بالنسب في خلايا PB-B (B220 + ، B) ، وخلايا T (TCRβ + ، T) ، وخلايا النخاع الشوكي (Mac-1 + ، My) على اليمين. (ب) Ikzf1 نشاط معزز في الخلايا التائية. تشير أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري) إلى تنوع تعبير GFP بين خطوط المؤسس المختلفة التي تم إنشاؤها بواسطة كل مراسل قائم على المُحسِّن. تم تقييم أهمية الاختلاف في تعبير GFP بين خطوط مراسل GFP من قبل الطالب ر اختبار *ص & lt 5 × 10 −3. (C) نشاط محسن D و H في LSK المخصب بـ HSC / MPP (Lin - c-Kit + Sca-1 +) ، كما هو محدد بالتعبير عن B-ص-مراسلين GFP-D و -H مقارنة بالوالدين B-ص-GFP مراسل. يتم تعريف LMPP على أنه LSK Flt3 + (بوابة مربعة). يظهر تعبير GFP في LSK كرسم بياني أو مع تعبير Flt3 كمخطط كفاف. يمثل الرسم البياني ذو الخط الرمادي الرفيع عنصر تحكم سلبي للمراسل.

خصوصية نوع خلية Ikzf1 معززات. (أ) تظهر الرسوم التخطيطية لبنى المراسل المستخدمة في هذه الدراسة على اليسار. يتم تلخيص أنماط تعبير GFP الخاص بالنسب في خلايا PB-B (B220 + ، B) ، وخلايا T (TCRβ + ، T) ، وخلايا النخاع الشوكي (Mac-1 + ، My) على اليمين. (ب) Ikzf1 نشاط معزز في الخلايا التائية. تشير أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري) إلى تنوع تعبير GFP بين خطوط المؤسس المختلفة التي تم إنشاؤها بواسطة كل مراسل قائم على المُحسِّن. تم تقييم أهمية الاختلاف في تعبير GFP بين خطوط مراسل GFP من قبل الطالب ر اختبار *ص & lt 5 × 10 −3. (C) نشاط محسن D و H في LSK المخصب بـ HSC / MPP (Lin - c-Kit + Sca-1 +) ، كما هو محدد بالتعبير عن B-ص-مراسلين GFP-D و -H مقارنة بالوالدين B-ص-GFP مراسل. يتم تعريف LMPP على أنه LSK Flt3 + (بوابة مربعة). يظهر تعبير GFP في LSK كرسم بياني أو مع تعبير Flt3 كمخطط كفاف. يمثل الرسم البياني ذو الخط الرمادي الرفيع عنصر تحكم سلبي للمراسل.

عرضت غالبية خطوط المؤسس التي تم إنشاؤها بواسطة أشرطة المراسل J و E و F و G و I نمط تعبير مماثل للكاسيت الأبوي (الشكل 3A-B الأشكال التكميلية 2 و 5 الجدول التكميلي 1). في تناقض حاد ، أعرب عدد كبير جدًا من خطوط مؤسس D و H عن GFP في جزء كبير من الخلايا التائية مقارنة بالمراسل الأبوي (34 ٪ و 43 ٪ مقارنة مع 4 ٪ الشكل 3A-B الأشكال التكميلية 2 و 3 الجدول التكميلي 1). كان متوسط ​​نسبة الخلايا النخاعية GFP + أعلى أيضًا في الخطوط المعدلة وراثيًا D (37 ٪ مقابل 22 ٪ الأشكال التكميلية 2 و 3 الجدول التكميلي 1). من بين كل Ikzf1 المعززات التي تم اختبارها هنا ، كان D هو الوحيد القادر على تحفيز تعبير المراسل في LMPP ، وهي الخطوة الأولى في تقييد النسب الليمفاوية ، فوق المستويات القاعدية المكتشفة في السكان المخصبين بـ HSC (الشكل 3C ، LSK Flt3 + vs LSK Flt3 -). 4

وهكذا ، في حين أن كل 6 من Ikzf1 كانت معززات (J ، D ، E ، F ، H ، I) نشطة في الخلايا B والخلايا النخاعية ، 2 (D و H) كانت نشطة أيضًا في الخلايا التائية وكانت مسؤولة على الأرجح عن التعبير العالي عن Ikzf1 في الغدة الصعترية اللازمة للنضج الطبيعي والتوازن. 1،9،17،25،26 واحدة من 2 Ikzf1 كانت المعززات الخاصة بالخلايا التائية (D) نشطة في LMPP وارتبطت بزيادة في تعبير Ikaros وتحريض إمكانات تمايز النسب اللمفاوية. 4،6

يلعب المحسن D دورًا غير مكرر في تنظيم النسخ Ikzf1

نظرًا للأهمية المحتملة للمُحسِّن D ، فقد درسنا كيف أثر حذفه على نشاط النسخ في Ikzf1 المكان. ان Ikzf1 تم تصميم استنساخ BAC مع مراسل CD2 البشري (hCD2) الذي تم إدخاله في exon 2 (Ik-BAC-hCD2) لاحتواء loxP مواقع التعرف التي تحيط بمنطقة 1.7 كيلو بايت D وتم اختبارها للتعبير عنها في الخلايا اللمفاوية والنقيوية قبل (Ik-BAC-lDl) وبعد الحذف بوساطة Cre (Ik-BAC-ΔD) (الشكل 4 أ). نظرًا لأن نواقل BAC هذه تم حقنها في بيض مخصب بشكل دائري ، فقد افترضنا أن الخطوط المعدلة وراثيًا التي تحتوي على 3 نسخ من الجين المحول لديها ≥1 استنساخ سليم من BAC. تم التعبير عن جميع المؤسسين الذين تم الحصول عليهم باستخدام Ik-BAC-hCD2 و Ik-BAC-lDl في 90 ٪ من الخلايا T و B والخلايا النخاعية ، حتى عند وجود نسختين من التحوير BAC (الشكل 4 ب). على النقيض من ذلك ، في جميع المؤسسين الذين تم الحصول عليهم باستخدام Ik-BAC-D ، تم اكتشاف تعبير شديد التنوع لمراسل hCD2 في جميع أنواع الخلايا ، بغض النظر عن رقم نسخة التحوير (الشكل 4C). وبالتالي ، فإن المُحسِّن D أمر بالغ الأهمية في مواجهة تأثيرات الكروماتين القمعية في Ikzf1 الموقع والحفاظ على النسخ عند مستويات عالية ، وهو نشاط لا يمكن أن يحل محله الآخر Ikzf1 معززات.

المحسن D مطلوب للنسخ العادي في موقع Ikzf1 (أ) رسم تخطيطي لملف Ikzf1 يبني مراسل BAC المعدلة وراثيا. أول exon مترجم (exon 2) في Ikzf1 تم استبدال استنساخ BAC بـ CD2 البشري (hCD2) الجين المراسل (مستطيل أبيض) تم إدخاله في كودون البدء (Ik-BAC-CD2). اثنان المرافقة loxP تم إدخال المواقع (مثلثات بيضاء) 5 ′ و 3 من المنطقة D (Ik-BAC-lDl). تم حذف المنطقة D من Ik-BAC-lDl بواسطة كري recombinase لتوليد بناء Ik-BAC-ΔD. (ب) تعبير المراسل في PBL من الخطوط المعدلة وراثيًا Ik-BAC مع منطقة D محسن سليم. (C) تعبير المراسل في PBL من الخطوط المعدلة وراثيا Ik-BAC-ΔD. يتم تسجيل رقم النسخة بجانب كل مؤسس تم إنشاؤه إما من Ik-BAC-CD2 أو خط Ik-BAC-DL. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا النخاعية hCD2 + (الأشرطة الرمادية) والخلايا التائية (الأشرطة السوداء) والخلايا البائية (الأشرطة البيضاء) لكل حيوان مؤسس عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة لـ Mac-1 و B220 و TCRβ ، على التوالي. ND ، لم تحدد.

المحسن D مطلوب للنسخ العادي في موقع Ikzf1 (أ) رسم تخطيطي لملف Ikzf1 يبني مراسل BAC المعدلة وراثيا. أول exon مترجم (exon 2) في Ikzf1 تم استبدال استنساخ BAC بـ CD2 البشري (hCD2) الجين المراسل (مستطيل أبيض) تم إدخاله في كودون البدء (Ik-BAC-CD2). اثنان المرافقة loxP تم إدخال المواقع (مثلثات بيضاء) 5 و 3 من المنطقة D (Ik-BAC-lDl). تم حذف المنطقة D من Ik-BAC-lDl بواسطة كري recombinase لتوليد بناء Ik-BAC-ΔD. (ب) تعبير المراسل في PBL من الخطوط المعدلة وراثيًا Ik-BAC مع منطقة D محسن سليم. (C) تعبير المراسل في PBL من الخطوط المعدلة وراثيا Ik-BAC-ΔD. يتم تسجيل رقم النسخة بجانب كل مؤسس تم إنشاؤه إما من Ik-BAC-CD2 أو خط Ik-BAC-DL. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا النخاعية hCD2 + (الأشرطة الرمادية) والخلايا التائية (الأشرطة السوداء) والخلايا البائية (الأشرطة البيضاء) لكل حيوان مؤسس عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة لـ Mac-1 و B220 و TCRβ ، على التوالي. ND ، لم تحدد.

توصيف رابطة الدول المستقلة-تصرف عناصر Ikzf1 محسن د

كما قمنا بتمييز رابطة الدول المستقلة-تأثير العناصر المسؤولة عن أنشطة المحسن د. احتوت منطقة 1.7 كيلو بايت التي تشمل هذا المُحسِّن على 7 مناطق أصغر (D1-D7) لحفظ قوي للفأر البشري (86٪ -96٪) يتراوح حجمها من 37 إلى 103 نقطة أساس (الشكل 5 أ التكميلي الشكل 6 الجدول التكميلي 3). تم تجميع المناطق الأربعة الأولى (D1-D4) في نهاية 5 وكانت مرتبطة بمواقع 2 DHS-C6 (الشكل 5A DHS-C6-a و DHS-C6-b) ، في حين أن المواقع الثلاثة الأخرى (D5- D7) ما مجموعه 394 قاعدة موجودة في الطرف 3 (الشكل 5 أ). تم استنساخ جزأين بقوة 500 نقطة أساس تشمل تسلسل D1 إلى D4 (DI) و D5 إلى D7 (DIII) ، على التوالي ، في B-ص- شريط كاسيت GFP وتقييمه للنشاط مقارنة بالناقل الأبوي 2 (الشكل 5 ب ب-ص-GFP و B-ص-GFP-D).

خاص بالخلايا التائية رابطة الدول المستقلة- عناصر التأثير في المحسن د. (أ) تظهر مناطق حفظ التسلسل (D1-D7) داخل مُحسِّن سعة 1.7 كيلو بايت D على شكل مستطيلات. تصور الخطوط الأفقية أسفل المنطقة D المنطقتين الفرعيتين DI و DIII بقدرة 500 نقطة أساس المستخدمة في المراسلين المعدلين وراثيًا. (ب) مقارنة تعبير المراسل بين B-ص-GFP-DI ، ب-ص-GFP-DIII ، ب-ص-GFP و B-ص- خطوط مؤسس GFP-D. تم تصوير تراكيب المراسل المستخدمة لإنشاء سطور المؤسس هذه على اليسار. يتم عرض عدد المؤسسين الذين عبروا عن GFP على إجمالي عدد المؤسسين الذين تم تكوينهم. الدلالة الإحصائية للفرق (زيادة أو نقصان) في نسبة المؤسس المعبر عن GFP مقارنة بالأب ب-ص-خط GFP (أ) أو ب-ص-GFP-D (ب) تم توفيره من خلال تحليل χ 2 ويظهر على شكل أ ص القيمة. تم توضيح النسبة المئوية لـ PBLs الإيجابية لـ GFP لكل خط مؤسس (دائرة). تم حساب متوسط ​​النسبة المئوية لـ GFP + PBLs لكل مراسل معدل وراثيًا إما لجميع المؤسسين الذين يعبرون عن GFP (الشريط الأسود) أو جميع المؤسسين (الشريط الرمادي). خصوصية نوع الخلية لكل مراسل موضحة على اليمين. (ج) مؤسسة التمويل الأصغر لـ GFP + PBLs من B-ص-GFP-D ، ب-ص-GFP-D-I و B-ص- تم حساب الخطوط المعدلة وراثيا GFP-D-III لكل مؤسس (الماس الرمادي). تشير الخطوط الرمادية إلى متوسط ​​مؤسسة التمويل الأصغر بين جميع المؤسسين ، بينما تشير الخطوط السوداء إلى متوسط ​​مؤسسة التمويل الأصغر بين المؤسسين الذين يعبرون عن GFP. (د) تعبير GFP الخاص بالنسب في PBLs من B-ص-GFP-D ، ب-ص-GFP-DI و B-صمؤسسو GFP-DIII. يظهر متوسط ​​النسبة المئوية لخلايا GFP + داخل خلايا الدم المحيطية B (B) والخلايا T (T) والخلايا النخاعية (My). تم تقييم أهمية اختلاف التعبير بين مراسلي GFP من قبل الطالب ر اختبار *ص & lt 5 × 10 −2 **ص & lt 5 × 10 −3. تشير أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري) إلى تنوع تعبير GFP بين خطوط المؤسس المختلفة التي قام بها كل مراسل قائم على المحسن.

خاص بالخلايا التائية رابطة الدول المستقلة- عناصر التأثير في المحسن د. (أ) تظهر مناطق حفظ التسلسل (D1-D7) داخل مُحسِّن سعة 1.7 كيلو بايت D على شكل مستطيلات. تصور الخطوط الأفقية أسفل المنطقة D المنطقتين الفرعيتين DI و DIII بقدرة 500 نقطة أساس المستخدمة في المراسلين المعدلين وراثيًا. (ب) مقارنة تعبير المراسل بين B-ص-GFP-DI ، ب-ص-GFP-DIII ، ب-ص-GFP و B-ص- خطوط مؤسس GFP-D. تم تصوير تراكيب المراسل المستخدمة لإنشاء سطور المؤسس هذه على اليسار. يتم عرض عدد المؤسسين الذين عبروا عن GFP على إجمالي عدد المؤسسين الذين تم تكوينهم. الدلالة الإحصائية للفرق (زيادة أو نقصان) في نسبة المؤسس المعبر عن GFP مقارنة بالأب ب-ص-خط GFP (أ) أو ب-ص-GFP-D (ب) تم توفيره من خلال تحليل χ 2 ويظهر على شكل أ ص القيمة. تم توضيح النسبة المئوية لـ PBLs الإيجابية لـ GFP لكل خط مؤسس (دائرة). تم حساب متوسط ​​النسبة المئوية لـ GFP + PBLs لكل مراسل معدل وراثيًا إما لجميع المؤسسين الذين يعبرون عن GFP (الشريط الأسود) أو جميع المؤسسين (الشريط الرمادي). خصوصية نوع الخلية لكل مراسل موضحة على اليمين. (ج) مؤسسة التمويل الأصغر لـ GFP + PBLs من B-ص-GFP-D ، ب-ص-GFP-D-I و B-ص- تم حساب الخطوط المعدلة وراثيا GFP-D-III لكل مؤسس (الماس الرمادي). تشير الخطوط الرمادية إلى متوسط ​​مؤسسة التمويل الأصغر بين جميع المؤسسين ، بينما تشير الخطوط السوداء إلى متوسط ​​مؤسسة التمويل الأصغر بين المؤسسين الذين يعبرون عن GFP. (د) تعبير GFP الخاص بالنسب في PBLs من B-ص-GFP-D ، ب-ص-GFP-DI و B-صمؤسسو GFP-DIII. يظهر متوسط ​​النسبة المئوية لخلايا GFP + داخل خلايا الدم المحيطية B (B) والخلايا T (T) والخلايا النخاعية (My). تم تقييم أهمية اختلاف التعبير بين مراسلي GFP من قبل الطالب ر اختبار *ص & lt 5 × 10 −2 **ص & lt 5 × 10 −3. تشير أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري) إلى تنوع تعبير GFP بين خطوط المؤسس المختلفة التي قام بها كل مراسل قائم على المحسن.

أنتج كلا النطاقين الفرعيين للمحسن عددًا كبيرًا من خطوط التأسيس التي كانت قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في المحسن السليم D (الشكل 5 ب). ومع ذلك ، ضمن المجموعات السكانية التي تم التعبير عنها ، كان التلون المراسل أكبر مقارنةً بالمُحسِّن السليم. في المتوسط ​​، أعرب 42 ٪ من PBLs من خطوط مؤسس D عن GFP ولكن فقط 27 ٪ أو 15 ٪ من PBL من مؤسسي DI أو DIII عبروا عن GFP ، على التوالي (الجدول التكميلي 5B الشكل 2).

اختلف مستوى تعبير المراسل المدعوم من النطاقات الفرعية D المعززة 2 اختلافًا كبيرًا ، فكان مستوى التعبير عن طريق DIII أقل بكثير مقارنةً بـ DI أو مع المحسن الأبوي السليم (الشكل 5C-D MFI: 512 مقابل 1282 أو 512 مقابل 1567). كان التعبير المدعوم من DI مشابهًا للتعبير عن المحسن السليم (الشكل 5C MFI: 1282 مقابل 1567). علاوة على ذلك ، كان DI وليس DIII قادرًا على منح التعبير في جزء كبير من الخلايا التائية (الشكل 5B ، D الشكل التكميلي 4 الجدول التكميلي 2). وفقًا لهذه المعايير ، كان للمنطقة الفرعية DI خصائص نسخ وخصائص خاصة بنوع الخلية مثل مُحسِّن الطول الكامل D.

مزيج من Ikzf1 تعمل المعززات كمنطقة تحكم في الموقع

عند اختباره بشكل فردي ، فإن Ikzf1 كانت المعززات قادرة على التخفيف بشكل ملموس ولكن ليس بشكل كامل من PEV على تعبير المراسل (الشكل 2). يشير هذا إلى أن أنشطة المُحسِّن المشتركة ، كما تمت مواجهتها في Ikzf1 الموضع ، مطلوب لتعبير Ikaros المناسب في الخلايا اللمفاوية النخاعية.

لاختبار هذه الفرضية ، أنشأنا مراسلًا معدلاً وراثيًا يجمع معظم هذه العناصر ، مع الحفاظ على اتجاهها كما هو الحال في الموقع الداخلي (موضع Ikaros التنظيمي الصغير [Ik-MC2] الشكل 6 أ). عرض ثمانية من 11 مؤسسًا إيجابيًا للتحوير الجيني تعبير مراسل GFP في ما يقرب من 100 ٪ من الخلايا البائية والخلايا التائية والخلايا النخاعية في PBLs (الشكل 6 ب). قد يكون المؤسسون الثلاثة الذين لديهم تعبير مراسل منخفض بسبب تكامل مراسل غير مكتمل معدل وراثيًا في الجينوم. وبالتالي ، فإن النشاط المشترك للعناصر التنظيمية الموجودة في كاسيت Ik-MC2 يمكن أن يقاوم PEV ويوفر نمطًا داخليًا يشبه Ikaros للتعبير في PBLs (الشكل 6B).

النشاط المشترك من Ikzf1 العناصر التنظيمية في الخلايا الليمفاوية والخلايا العصبية. (أ) رسم تخطيطي لبناء Ik-MC2. (ب) تعبير مراسل GFP في مجموعات فرعية PBL لخطوط مؤسس Ik-MC2. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا النخاعية GFP + (الأشرطة الرمادية) ، والخلايا التائية (الأشرطة السوداء) ، والخلايا البائية (الأشرطة البيضاء) لكل خط مؤسس عن طريق تحليل فارز الخلايا (FACS) الذي ينشط الفلورة. (C) تعبير GFP في HSC المخصب (LSK) و erythro-myeloid (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -) السكان السلف لنخاع العظام. يتم عرض تعبير CD34 و Flt3 في مجموعات فرعية LSK و LK GFP (hi) والمنخفضة (lo). يمثل الرسم البياني ذو الخطوط الرفيعة تلطيخ FACS لمراسل أو عنصر تحكم سلبي للعلامة. (د) عرض جانبي لتعبير GFP في الدماغ P0 في جبل كامل. يظهر مخطط الدماغ كخط أبيض. لوحظ تعبير GFP الساطع في العقد القاعدية. لم يلاحظ أي مضان في الضوابط من النوع البري في ظل هذه الظروف. تشير الأقواس إلى المستوى التقريبي للقسم الأمامي الموضح في اللوحة E. (E) عرض تخطيطي للقسم الذي يشير إلى القشرة (COR) ، والبوتامين المذنبي (CP) ، والحاجز (S) والمنطقة الموضحة في الصورة (صندوق) . لوحظ تعبير GFP في البوتامين المذنبة. باستثناء الخلايا المتناثرة في مكان آخر ، لم يلاحظ GFP في الأنسجة المحيطة.

النشاط المشترك من Ikzf1 العناصر التنظيمية في الخلايا الليمفاوية والخلايا العصبية. (أ) رسم تخطيطي لبناء Ik-MC2. (ب) تعبير مراسل GFP في مجموعات فرعية PBL لخطوط مؤسس Ik-MC2. تم تحديد النسبة المئوية للخلايا النخاعية GFP + (الأشرطة الرمادية) ، والخلايا التائية (الأشرطة السوداء) ، والخلايا البائية (الأشرطة البيضاء) لكل خط مؤسس عن طريق تحليل فارز الخلايا (FACS) الذي ينشط الفلورة. (C) تعبير GFP في HSC المخصب (LSK) و erythro-myeloid (LK-Lin - c-Kit + Sca-1 -) السكان السلف لنخاع العظام. يتم عرض تعبير CD34 و Flt3 في مجموعات فرعية LSK و LK GFP (hi) والمنخفضة (lo). يمثل الرسم البياني ذو الخطوط الرفيعة تلطيخ FACS لمراسل أو عنصر تحكم سلبي للعلامة. (د) عرض جانبي لتعبير GFP في الدماغ P0 في جبل كامل. يظهر مخطط الدماغ كخط أبيض. لوحظ تعبير GFP الساطع في العقد القاعدية. لم يلاحظ أي مضان في الضوابط من النوع البري في ظل هذه الظروف. تشير الأقواس إلى المستوى التقريبي للقسم الأمامي الموضح في اللوحة E. (E) عرض تخطيطي للقسم الذي يشير إلى القشرة (COR) ، والبوتامين المذنبي (CP) ، والحاجز (S) والمنطقة الموضحة في الصورة (مربع) . لوحظ تعبير GFP في البوتامين المذنبة. باستثناء الخلايا المتناثرة في مكان آخر ، لم يلاحظ GFP في الأنسجة المحيطة.

قمنا أيضًا بتقييم ملف تعريف التعبير الخاص بشريط Ik-MC2 في HSCs وفي الأسلاف المقيدة للنسب المبكرة. كان هذا مشابهًا جدًا لما تم وصفه سابقًا للمراسلين المحتويين على المحسن D (الشكل 3C B-ص-GFP-D و B-ص-GFP-C). 4 يفصل التعبير ثنائي النسق لمراسل GFP المدعوم بواسطة كاسيت Ik-MC2 LMPP عن HSC متعدد الإمكانات (الشكل 6C LSK Flt3 ++: GFP hi من LSK Flt3 neg – lo: GFP lo). كما أنها فصلت أسلاف الخلايا البلعمية المحببة عن أسلاف خلايا الدم الحمراء الضخمة في مجموعة سلفية مختلطة من الكريات الحمر النخاعية (الشكل 6C LK CD34 +: GFP مرحبًا من LK CD34 neg-lo: GFP +). 4

Ikzf1 يتم التعبير عنه أيضًا في المخطط النامي ، 27،28 حيث قد يلعب دورًا في وظيفة السلف العصبي. 29،30 على النقيض من محسن د أو غيره Ikzf1 معززات تم اختبارها في عزلة ، دعم نشاطهم المشترك تعبير GFP في المخطط (الشكل 6D-E). كشفت المقاطع الموجودة في هذه المنطقة من الدماغ عن تعبير في جميع أنحاء البوتامين المذنّب مشابهًا لذلك الذي أظهره الجسم الداخلي. Ikzf1 موضع (الشكل 6D-E).

وهكذا ، فإن الجمع بين 9 من 10 من Ikzf1 تضمن المناطق المحفوظة (J ، B ، p ، D ، E ، F ، G ، H ، I) في موضع منظم صغير التعبير الجيني في خلايا النخاع اللمفاوي والنسب العصبي بطريقة تشبه خصوصية نوع الخلية في ذاتية النمو Ikzf1 الموضعية والتي لم تتأثر بتأثيرات إسكات الكروماتين المحلي.

تنظيم شبكة عوامل النسخ Ikzf1 التعبير

للحصول على نظرة ثاقبة لعوامل النسخ المشاركة في Ikzf1 التنظيم ، تم إجراء بحث عزر عن مواقع ربط عامل النسخ في المعززات D و H. تم إثراء المحسن D بشكل خاص بمواقع الربط لعوامل النسخ المعبر عنها في أسلاف المكونة للدم المبكرة مثل Runx (Runx1-3) ، Homeobox A9 (هوكسا 9) ، بروتين ربط تسلسل غني خاص بـ AT 1 (Satb1) ، عوامل تنظيم interferon (Irf1 ، Irf4) ، CCAAT / بروتينات ربط المحسن (سيبا ، سيب) ، وعامل محسن الخلايا العضلية 2C (Mef2c) (الشكل 7B الجدول التكميلي 7D-H). لم تكن مواقع ارتباط عامل النسخ اللمفاوي النخاعي المبكرة هذه موجودة في المُحسِّن H. ومع ذلك ، فإن العديد من مواقع ارتباط العوامل المشتركة لعوامل النسخ التي تم الإبلاغ عنها سابقًا في الخلايا التائية كانت موجودة في المعززات D و H ، مثل E2A (Tcf3) ، Ets-1 (إتس 1) ، Tal-1 (Tal1) و Ikaros (Ikzf1) (الجدول التكميلي 7 د ، ح الشكل 7 ب). قدم تشريح إضافي لـ D في المناطق الفرعية DI و DIII دليلاً مستقلاً على أن الأنشطة الخاصة بالخلايا التائية والخاصة بالمُحسِّن D موجودة داخل المنطقة الفرعية DI (الجدول التكميلي 7DI-DIII الشكل 7B).

استهداف شبكة عوامل النسخ Ikzf1 معززات. (أ) قمم تخصيب TF عند Ikzf1 تم تصور الموقع في الخلايا التوتية (الخلايا التائية) ، و CH12 (الخلايا البائية) ، والسلائف الحمراء بواسطة مستعرض IGV. يتم توفير ملخص للأنشطة التنظيمية أعلاه مناطق التعزيز المعنية في Ikzf1 المكان. (B-C) نموذج Ikzf1 اللائحة. (ب) Ikzf1 تفاعلات المحسن-المروج أثناء تكون الدم. تُمكّن العوامل الخاصة بالكرات الحمر المرتبطة في المُحسِّن G من التفاعلات مع المروج النخاعي النوعي A وتعبير Ikaros أثناء تكون الكريات الحمر المبكرة. عوامل محددة مرتبطة بالنخاع اللمفاوي في المحسنات D و H تدعم التفاعلات مع المحفز B و Ikaros النوعي اللمفاوي أثناء التمايز اللمفاوي والنقوي. تم تصوير عوامل النسخ الخاصة بالنسب في هذه المواقع على أنها دوائر مشفرة بالألوان. تشير الأسهم إلى التفاعلات المحتملة بين المعززات والمروجين الداعمين لنوع الخلية Ikzf1 التعبير في مراحل نمو مناسبة. (ج) Ikzf1 نشاط المنطقة التنظيمية خلال تكون اللمفاويات. ال Ikzf1 المروج اللمفاوي النخاعي B ، على الرغم من نشاطه من HSCs من خلال الخلية B والتمايز النخاعي ، إلا أنه يتطلب مدخلات من مُحسِّن للتغلب على تأثيرات الكروماتين المقيدة و PEV (الدائرة الصفراء). المعززات J و D (C) و E و F و H و I تتصدى لـ PEV وترفع Ikzf1 التعبير الجيني (الدائرة البرتقالية). ل Ikzf1 التعبير بعد مرحلة DN لتطوير الخلايا التائية ، مطلوب إدخال من معززات D (C) (أزرق) و H (أخضر). تحريض Ikzf1 التعبير في LMPP إلى المستوى المطلوب لتمايز الخلايا الليمفاوية يعتمد على نشاط المحسن D (C) (الأزرق).

استهداف شبكة عوامل النسخ Ikzf1 معززات. (أ) قمم تخصيب TF عند Ikzf1 تم تصور الموقع في الخلايا التوتية (الخلايا التائية) ، و CH12 (الخلايا البائية) ، والسلائف الحمراء بواسطة مستعرض IGV. يتم توفير ملخص للأنشطة التنظيمية أعلاه مناطق التعزيز المعنية في Ikzf1 المكان. (B-C) نموذج Ikzf1 اللائحة. (ب) Ikzf1 تفاعلات المحسن-المروج أثناء تكون الدم. تُمكّن العوامل الخاصة بالكرات الحمر المرتبطة في المُحسِّن G من التفاعلات مع المروج النخاعي النوعي A وتعبير Ikaros أثناء تكون الكريات الحمر المبكرة. عوامل محددة مرتبطة بالنخاع اللمفاوي في المحسنات D و H تدعم التفاعلات مع المحفز B و Ikaros النوعي اللمفاوي أثناء التمايز اللمفاوي والنقوي. تم تصوير عوامل النسخ الخاصة بالنسب في هذه المواقع على أنها دوائر مشفرة بالألوان. تشير الأسهم إلى التفاعلات المحتملة بين المعززات والمروجين الداعمين لنوع الخلية Ikzf1 التعبير في مراحل نمو مناسبة. (ج) Ikzf1 نشاط المنطقة التنظيمية خلال تكون اللمفاويات. ال Ikzf1 المروج اللمفاوي النخاعي B ، على الرغم من نشاطه من HSCs من خلال الخلية B والتمايز النخاعي ، إلا أنه يتطلب مدخلات من مُحسِّن للتغلب على تأثيرات الكروماتين المقيدة و PEV (الدائرة الصفراء). المعززات J و D (C) و E و F و H و I تتصدى لـ PEV وترفع Ikzf1 التعبير الجيني (الدائرة البرتقالية). ل Ikzf1 التعبير بعد مرحلة DN لتطوير الخلايا التائية ، مطلوب إدخال من معززات D (C) (أزرق) و H (أخضر). تحريض Ikzf1 التعبير في LMPP إلى المستوى المطلوب لتمايز الخلايا الليمفاوية يعتمد على نشاط المحسن D (C) (الأزرق).

عوامل النسخ مع مواقع الربط المفترضة في Ikzf1 تم تقييم العناصر التنظيمية بشكل أكبر من خلال تحليل بيانات ChIP-seq في Ikzf1 موضع 17،19،31 (الشكل 7 أ). العديد من العوامل الرائدة في النسب الليمفاوية مثل Ikaros و HEB و Runx1 و TCF-1 المرتبطة في مواقع متعددة في Ikzf1 المكان. دعم المحسن D الإثراء القوي للعديد من عوامل النسخ المعبر عنها من المراحل المبكرة إلى المراحل اللاحقة من التمايز اللمفاوي (E-box / HEB و Runx1 و TCF-1 و Ets-1 و c-Myc) ، بما يتوافق مع النشاط الواسع للمعزز من الأسلاف المبكرة إلى المراحل اللاحقة في تمايز الخلايا الليمفاوية ودورها الرئيسي في Ikzf1 اللائحة. ومن المثير للاهتمام ، أن المُحسِّن المجاور E أظهر إثراءًا مشابهًا لـ D لعوامل النسخ ، على الرغم من أن نشاطه في الجسم الحي كان أكثر تقييدًا. كان لمحسن H مع نشاط فقط في الخلايا التائية ذخيرة محدودة من عوامل النسخ التي تضمنت Ikaros و TCF-1 و Ets-1 و c-Myc. أخيرًا ، تم اكتشاف جميع عوامل النسخ التي تعزز اللمفاوية المرتبطة بالمحفز اللمفاوي النخاعي B ، في حين تم اكتشاف ارتباط عامل النسخ المحدد للكريات الحمر GATA-1 بالقرب من المحفز A الخاص بالنخاع العظمي ، والذي تم تمييزه على وجه التحديد بواسطة H3K4me3 و H3K9Ac في أسلاف الكريات الحمر. تحليل عامل نسخ الكريات الحمر مثل GATA-1 و GATA-2 و SCL / Tal-1 (Tal1) التخصيب في مناطق F و G بالقرب من H3K9Ac ، مما يشير إلى أن هذه قد تكون معززات مسؤولة عن دعم تعبير Ikaros في أسلاف الكريات الحمر. (الشكل 7 أ-ب).


المقدمة

كان الميل المتأصل في الجوانين إلى الارتباط الذاتي لتشكيل هياكل حلزونية ذات أربعة شرائط معروفًا منذ أوائل الستينيات (1). بعد ذلك ، تم إثبات أن تكرار تسلسل الحمض النووي المحفوظ للتيلوميرات يشكل هياكل G-quadruplex (أو G4) في المختبر (2 ، 3). منذ ذلك الحين ، أثبتت العديد من التحليلات البيوكيميائية والهيكلية أن تسلسلات الحمض النووي ، كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، تحتوي على مجموعات من الجوانين (G-tracts) مفصولة بقواعد أخرى تنطوى تلقائيًا في هياكل G-quadruplex في المختبر. اللبنات الأساسية لـ G-quadruplexes هي G-quartets التي يتم تشكيلها من خلال ترتيب رابطة Hoogsten الهيدروجين الدوري لأربعة جوانين مع بعضها البعض. تتراكم G-quartets المستوية فوق بعضها البعض لتشكل هياكل حلزونية بأربعة خيوط. يتم تشكيل G-quadruplex بواسطة الكاتيونات أحادية التكافؤ مثل Na + و K + ، وبالتالي فإن ظروف المخزن الفسيولوجي تفضل تكوينها (الشكل 1 أ).

هيكل G-quadruplexes. شكل G- الرباعي في المختبر في تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مساحات من ثلاثة إلى أربعة جوانين. (أ) اللبنات الأساسية لـ G-quadruplexes هي G-quartets التي تنشأ من ارتباط أربعة جوانين بترتيب دوري مستقر بواسطة رابطة Hoogsten الهيدروجينية (N1 N6 و N2 N7). تتراكم G-quartets المستوية فوق بعضها البعض ، وتشكل هياكل حلزونية بأربعة خيوط. يتم تشكيل G-quadruplex بواسطة كاتيونات أحادية التكافؤ مثل Na + و K +. (ب) هياكل G-quadruplex متعددة الأشكال ويمكن تصنيفها إلى مجموعات فرعية في عائلات مختلفة ، على سبيل المثال متوازية أو عكسية وفقًا لاتجاه السلاسل ويمكن طيها بين الجزيئات أو داخلها. يعتمد نوع الهيكل على عدد المسالك G في حبلا.

هيكل G-quadruplexes. شكل G- الرباعي في المختبر في تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مساحات من ثلاثة إلى أربعة جوانين. (أ) اللبنات الأساسية لـ G-quadruplexes هي G-quartets التي تنشأ من ارتباط أربعة جوانين بترتيب دوري مستقر بواسطة رابطة Hoogsten الهيدروجينية (N1 N6 و N2 N7). تتراكم G-quartets المستوية فوق بعضها البعض ، وتشكل هياكل حلزونية بأربعة خيوط. يتم تشكيل G-quadruplex بواسطة كاتيونات أحادية التكافؤ مثل Na + و K +. (ب) هياكل G-quadruplex متعددة الأشكال ويمكن تصنيفها إلى مجموعات فرعية في عائلات مختلفة ، على سبيل المثال متوازية أو عكسية وفقًا لاتجاه السلاسل ويمكن طيها بين الجزيئات أو داخلها. يعتمد نوع الهيكل على عدد المسالك G في حبلا.

هياكل G-quadruplex متعددة الأشكال طوبولوجيًا ويمكن أن تنشأ من الطي داخل الجزيئات أو بين الجزيئات للخيوط الغنية بـ G. يتطلب الطي داخل الجزيئات وجود أربعة أو أكثر من مسارات G في حبلا واحد ، في حين أن الطي بين الجزيئات يمكن أن ينشأ من اثنين أو أربعة خيوط مما يؤدي إلى إنشاء هياكل متوازية أو عكسية اعتمادًا على اتجاه الخيوط في G-quadruplex ( 4 ، 5) (الشكل 1 ب). تعد معرفة التركيب الدقيق ثلاثي الأبعاد (6) أمرًا مهمًا لتصميم روابط تثبيت G-quadruplex المستخدمة في التحقيق في عواقب تثبيت G-quadruplex على عمليات مثل تكرار الحمض النووي ونسخ الجينات ، وكأدوية مضادة للسرطان لاستهداف G-quadruplexes في مروجي الجينات المسرطنة والتيلوميرات (7). يعتمد الاستقرار الحراري لـ G-quadruplexes على ميزات مثل عدد G-quartets الموجودة في الهيكل وطول وتكوين الحلقات المكونة من قواعد غير جوانين (8 ، 9). ومع ذلك ، فإن الاستقرار الحراري لـ G-quadruplex في المختبر قد لا ترتبط به في الجسم الحي تأثير (11). في المختبر العديد من هياكل الحمض النووي G-quadruplex ، بمجرد تشكيلها ، تكون أكثر استقرارًا من الناحية الديناميكية الحرارية من الحمض النووي المزدوج الشريطة ، والأهم من ذلك بالنسبة للوظيفة البيولوجية ، فإن حركتها تتكشف أبطأ بكثير من تلك الخاصة بهياكل دبوس الشعر DNA أو RNA (10). لذلك ، بشكل عام ، من المحتمل أن تعرقل هياكل G-quadruplex استقلاب الحمض النووي الريبي (DNA) والحمض النووي الريبي (RNA) ، وبالتالي يجب تنظيم تكوينها. على مدى السنوات العديدة الماضية ، تزايدت الأدلة المباشرة على وجود G-quadruplexes في الجسم الحي، وقد بدأ تحديد البروتينات التي تنظم على وجه التحديد طي G-quadruplex وتكشفها في توفير نظرة ثاقبة لحدوث G-quadruplex ووظيفته.

G-quadruplexes المحتملة في الجينوم البشري

التحليلات الحسابية للجينوم البشري التي تبحث عن تسلسل الإجماع (G3+ن1–7جي3+ن1–7جي3+ن1–7جي3+) أنه يحتوي على أكثر من 300000 تسلسل لديها القدرة على تكوين G-quadruplexes (pG4 أو PQS) (12). من المحتمل أن يكون هذا تبسيطًا مفرطًا لأن التسلسلات غير المتوافقة قد تشكل G-quadruplexes (13) ، بالإضافة إلى التقليل من التقدير نظرًا لأن التشغيلات الطويلة لتسلسلات الحمض النووي المتكررة مفقودة من قاعدة بيانات التسلسل المتاحة (S. Schuster ، الاتصال الشخصي). بشكل ملحوظ ، وجد أن توطين pG4s غير عشوائي: pG4 تتحد مع المناطق الوظيفية في الجينوم ، علاوة على ذلك ، يتم حفظها بشكل كبير بين الأنواع المختلفة (8) مما يشير إلى ضغط الاختيار للاحتفاظ بهذه التسلسلات في مواقع جينومية محددة. هذا الحفظ هو الأعلى بين أنواع الثدييات وينخفض ​​في الأنواع غير الثديية والكائنات الحية الأدنى (14). أخيرًا ، توجد جزيئات pG4 أيضًا في البكتيريا (15) وفيروسات الحمض النووي الريبي البشري والحمض النووي الريبي (16-18).

توجد أعلى وفرة من pG4 في التيلوميرات ، والتي تتكون عند البشر من 5 إلى 10000 نقطة أساس من تكرار TTAGGG المرتب بالترادف. كما أنها غنية أيضًا بمحفزات الجينات ، على الحدود بين الإنترونات والإكسونات وإعادة تركيب تبديل فئة الجين المناعي المستهدف (9). الأكثر إثارة للاهتمام هو أنه ظهر مؤخرًا أن 90٪ من أصول استنساخ الحمض النووي البشري تحتوي على أشكال pG4 ، وبكثافة أعلى بالقرب من الأصول تُستخدم بشكل متكرر (19-21) (الشكل 2 أ-ج). يُظهر التحليل على مستوى الجينوم لنقاط توقف الحمض النووي في أنواع السرطان المختلفة إثراءًا كبيرًا في pG4s بالقرب من تعديلات عدد النسخ الجسدية (22) ، بالإضافة إلى أن التيلوميرات تكون أهدافًا مفضلة لاستجابة تلف الحمض النووي المستمر في الشيخوخة (23). وقد وجد أيضًا أنه في حوالي 3000 جين بشري ، توجد pG4s في المنطقة التي تحدد 5′-UTR من mRNAs المشفرة وقد تكبح الترجمة (الشكل 2 د) (24 ، 25). نسخ RNA الطويلة الغنية بـ G-G من DNA telomeric ، TERRA ، غنية أيضًا بـ pG4s (26). تشير كل هذه الملاحظات عن الوجود المحفوظ لـ pG4s في مناطق جينومية مهمة إلى أنها توفر دورًا تنظيميًا من خلال قدرتها على تكوين هياكل G-quadruplex. سواء أكان كل أو مجموعة فرعية من pG4s الموجودة في الجينوم لها امتداد في الجسم الحي لا يزال يتعين إنشاء وظيفة.

المواقع المحتملة لهياكل G-quadruplex في الخلايا. كشفت عمليات البحث على نطاق الجينوم عن موقع المناطق الغنية بـ G مع إمكانات تشكيل G-quadruplex (pG4). يتم توزيع pG4s بشكل غير عشوائي في الجينوم ويتم إثراء المحفزات والتيلوميرات بشكل خاص في هذه التسلسلات. في النواة ، يمكن أن يحدث تكوين G-quadruplex في مناطق مزدوجة غنية بـ G عندما يصبح الحمض النووي عابرًا بشكل عابر ، أثناء (أ) النسخ و (ج) التكرار و (ب) في الأجزاء المتراكمة من التيلومريك G-rich التي تقطعت بهم السبل. خارج النواة ، يمكن أن تتشكل G-quadruplexes أيضًا في mRNA و (د) تشارك في التحكم الترجمي. تشير أشرطة T الحمراء إلى معوقات النسخ والنسخ والترجمة.

المواقع المحتملة لهياكل G-quadruplex في الخلايا. كشفت عمليات البحث على نطاق الجينوم عن موقع المناطق الغنية بـ G مع إمكانات تشكيل G-quadruplex (pG4). يتم توزيع pG4s بشكل غير عشوائي في الجينوم ويتم إثراء المحفزات والتيلوميرات بشكل خاص في هذه التسلسلات. في النواة ، يمكن أن يحدث تكوين G-quadruplex في مناطق G-rich المزدوجة التي تقطعت بها السبل عندما يصبح الحمض النووي عابرًا بشكل عابر ، خلال (أ) النسخ و (ج) التكرار و (ب) في الأجزاء المتراكمة من التيلومريك G-rich التي تقطعت بهم السبل. خارج النواة ، يمكن أن تتشكل G-quadruplexes أيضًا في mRNA و (د) تشارك في التحكم الترجمي. تشير أشرطة T الحمراء إلى معوقات النسخ والنسخ والترجمة.

بالنسبة إلى علم الأحياء ، فإن السؤال المهم هو ما إذا كانت مركبات pG4 المعينة تشكل هياكل G-quadruplex وأين ومتى في الجسم الحي. الحمض النووي الجينومي هو في المقام الأول مزدوج تقطعت به السبل واستقرار من خلال تعبئته في الكروماتين. هناك استثناءان هما النصائح الأساسية للكروموسومات حقيقية النواة الخطية التي لها السمة المحفوظة المتمثلة في النهاية في G-overgred أحادي الجديلة وفي mRNA. في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، تنشأ فرصة تكوين G-quadruplexes أثناء تكرار الحمض النووي والنسخ والإصلاح عندما يتم تقديم الحمض النووي بشكل عابر من خلال كسر اقتران قاعدة Watson-Crick ، ​​مما يسمح بإقران قاعدة Hoogsteen البديل الموجود في G-quadruplexes (27 ، 28) (الشكل 2). في الواقع ، الناشئة في الجسم الحي تتوافق الملاحظات مع تشكيل G-quadruplex والقرار الذي يوفر دورًا تنظيميًا في هذه المسارات (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور أن تشكيل G-quadruplex يمكن أن يكون مفضلًا عن طريق الإجهاد الفائق ، والتزاحم الجزيئي (29) وكذلك بروتينات ربط G-quadruplex محددة (30). علاوة على ذلك ، على عكس عقيدة اقتران قاعدة Watson-Crick ، ​​فقد وجد أن أزواج قاعدة Hoogsteen تتشكل بشكل عابر في DNA مزدوج تقطعت بهم السبل (31) ، مما يشير إلى أن تكوين G-quadruplex قد لا يتطلب بالضرورة الذوبان المسبق للحلزون المزدوج للحمض النووي من خلال ، على سبيل المثال ، تكرار الحمض النووي.

طفرة في تأسيس وجود وموقع G-quadruplexes في الجسم الحي منذ أكثر من عقد من الزمن من تطوير أجسام مضادة محددة موجهة ضد تيلومريك DNA G-quadruplexes. سمح هذا بالتخيل الأول المباشر بواسطة فى الموقع تلطيخ مناعي في النوى الدقيقة للهدب Stylonychia lemnae (32). في وقت لاحق ، تم استخدام الجسم المضاد G-quadruplex لرسم خريطة لموقع مثل هذه الهياكل في الحمض النووي الجيني البشري باستخدام الترسيب المناعي متبوعًا بالتسلسل العميق لشظايا الحمض النووي المحددة (33). كشفت هذه الدراسة عن وجودها في مواقع جينومية متعددة: في محفزات الجينات وفي كل من المناطق غير المترجمة 5 و 3 (UTRs) ، مما يشير إلى أدوار في كل من بدء النسخ وإنهائه ، داخل الإنترونات وفي المناطق الفرعية التيلوميرية. وتجدر الإشارة إلى أن الترسيب المناعي لهياكل G-quadruplex تم تنفيذه باستخدام DNA معزول ومجزأ ، لذلك لا يمكن استبعاد حدوث تكوين G-quadruplex أثناء التحليل. كان هناك نهج آخر لتحديد جينوم G-quadruplex على نطاق واسع وهو استخدام دواء بيريدوستاتين المتفاعل G-quadruplex ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي المعتمد على النسخ والنسخ. الترسيب المناعي للكروماتين مع جسم مضاد موجه ضد الجينات المحددة لتلف الحمض النووي هيستون جاما H2AX المخصب في pG4s (34). نظرًا لأن هذه الملاحظات تتوافق مع G-quadruplexes التي تشارك في العديد من العمليات البيولوجية ، فإن التوقع هو أن تكوين G-quadruplex ديناميكي ومنظم ، وبالتالي قد يختلف توزيعها في خلايا متباينة مختلفة. لذلك ، سيكون من الأهمية بمكان تعيين حدوث G-quadruplexes في الخلايا ذات الذخيرة النصية المختلفة.

تنظيم تشكيل G-quadruplex

من الاعتبارات الأساسية للمشاركة المحتملة لـ G-quadruplexes في علم الأحياء حركية التكوين (الطي) والقرار (الانطواء). كما كان متوقعًا ، تتراكم الأدلة التجريبية لدور مرافقي البروتين وهليكازات في تنظيم الطي والتكشف ، على التوالي. حركية الطي لتسلسلات تشكيل G-quadruplexes تعتمد على التسلسل وتتراوح من مللي ثانية إلى دقائق. بالنسبة للتسلسلات التي تطوي بسرعة كبيرة مثل التكرارات التيلوميرية البشرية ، يكون النطاق الزمني للطي في نطاق تكرار الحمض النووي (35). بالنسبة للآخرين ، يمكن زيادة حركية تكوين G-quadruplex بشكل كبير بواسطة مرافقي البروتين (36). الكثير من الأدلة المتاحة لدور المرافقين تأتي من في المختبر تعمل الدراسات ومعظم البروتينات المحددة في التيلوميرات: S. cerevisiae تم عرض بروتين ربط التيلومير المزدوج الشريط Rap1 قبل عقدين من الزمن لتعزيز تكوين G-quadruplex (37): كما كانت الوحدة الفرعية التنظيمية لتيلوميراز الخميرة Est1 (38): وقد تورط بروتين الربط التيلومري البشري TRF2 في كل من DNA و RNA (TERRA) ربط G-quadruplex (39). مقنع في الجسم الحي بدأت تظهر الأدلة: في المختبر تم تأكيد الملاحظة التي تفيد بأن البروتين المرتبط بنهاية التيلومير الهدبي TEBPβ يعزز تكوين G-quadruplexes بمقدار 10 5-6 أضعاف (36) بواسطة في الجسم الحي التجارب التي تثبت أن TEBPβ ينظم تكوين G-quadruplex في التيلوميرات بطريقة تعتمد على دورة الخلية (40). يرتبط عدم تطابق الحمض النووي البشري الذي يتعرف على العامل MutSα بـ G-quadruplexes ويعزز التشابك العصبي لمناطق تبديل الغلوبولين المناعي المنشط نسبيًا (41). تشير الدراسات الحديثة ذات الأهمية الخاصة إلى أن نوكليوفوسمين (NPM1) يتفاعل مع العديد من مناطق G-quadruplex في الحمض النووي الريبوزومي ، وكلاهما في المختبر و في الجسم الحي. NPM1 هو بروتين نووي وفير متورط في نضوج الريبوسوم وتصديره وهو الجين الأكثر تحورًا في ابيضاض الدم النخاعي الحاد (42). nucleolin بشكل ملحوظ ، (NCL) وهو بروتين فسفوري نووي أساسي قديم. في المختبر دليل على أنه يربط DNA G-quadruplexes مع تقارب عالٍ (43) ، ظهر مؤخرًا أنه تم عزله على وجه التحديد بطريقة تعتمد على التشكل بواسطة G-quadruplexes الموجودة في نسخ RNA المجهضة الناشئة عن توسيع تكرار hexanucleotide (GGGCC) n ( الشكل 4 ب). أدى هذا إلى إجهاد نووي واضطرابات في معالجة الحمض النووي الريبي ، مما أدى إلى بدء سلسلة جزيئية أدت إلى نوع من اضطراب التنكس العصبي (44).

تتراكم الآن الأدلة التي تشير إلى تورط طائرات الهليكوبتر المتخصصة في تفكيك الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي G-quadruplexes. Helicases هي عائلة كبيرة من إنزيمات تفكيك الحمض النووي المعتمدة على ATP والتي لها دور رئيسي في صيانة الجينوم. الأهم من ذلك ، أن طفرات فقدان الوظيفة في عائلة متميزة من هليكازات الحمض النووي المرتبطة بمختلف أنواع السرطان والاضطرابات الجينية قد وفرت رابطًا مباشرًا بين تسلسل pG4 وعدم استقرار الجينوم. لقد ظهر أن مروحيات G-quadruplex تلعب أدوارًا مهمة في تكرار الحمض النووي وصيانة التيلومير (انظر أدناه) (45). المروحيات البشرية WRN و BLM و S. cerevisiae يشارك Sgs1 في صيانة التيلومير وله نشاط فك رباعي G في المختبر وتحتوي على مجال RQC محفوظ يربط G-quadruplexes بتقارب عالٍ (30). تسبب الطفرات في WRN متلازمة ويرنر وطفرات في متلازمة بلوم بلومز ، التي تؤدي إلى الشيخوخة المبكرة (الشيخوخة المبكرة للبالغين) وزيادة خطر الإصابة بالسرطان ، على التوالي. سلامة C. ايليجانس DOG-1gene (حذف الحمض النووي الغواني الغواني) أمر بالغ الأهمية لاستقرار المسالك G في الجينوم (46). علاوة على ذلك ، إدخال تسلسل DNA الذي يشكل G-quadruplexes في المختبر كانت شديدة الطفرات وتمت إزالتها من الجينومات التي تفتقر إلى DOG-1 (47). دراسات على الهليكاز FANCJ للثدييات ، وهو أخصائي تقويم العظام C. ايليجانس DOG-1 هيليكاز ، عزز هذه النتائج. ترتبط الهليكاز FANCJ بمرض فقر الدم فانكوني الوراثي. تتراكم خطوط الخلايا من المرضى الذين يفتقرون إلى FANCJ عمليات حذف كبيرة من الحمض النووي الجينومي والتي ترتبط بـ pG4s (48). التظاهر بأن FANCJ تفكك بشكل تفضيلي G-quadruplexes على ركائز الحمض النووي الأخرى في المختبر اقترح أن طائرة FANCJ ، مثل DOG-1 ، تعمل في حل عوائق النسخ المتماثل المحتملة التي تسببها مضاعفات الحمض النووي G-quadruplexes (48). الطفرات في منظم هليكاز الحمض النووي للثدييات بطول التيلومير يمنح RETL1 قابلية متزايدة لأنواع معينة من السرطانات (49). بسبب تشابهها مع FANCJ البشري و C. ايليجانس هليكازات DOG-1 ، وبسبب الزيادة الملحوظة في هشاشة التيلومير عن طريق العلاج بمركب تثبيت G-quadruplex TMPyP4 ، كان RETL1 متورطًا في فك G-quadruplex (50). ومع ذلك ، هناك نقص في الأدلة البيوكيميائية المباشرة لهذا النشاط. تقدم الدراسات التي أجريت على عائلة PIF1 DNA هيليكس ، والتي يتم حفظها من البكتيريا إلى الإنسان ، دليلًا قويًا على نشاط تفكيك G-quadruplex الفعال في المختبر (51). ترسيب مناعي للكروماتين واسع الجينوم لـ S. cerevisiae كشف Pif1 عن pG4s في مجموعة فرعية رئيسية من مواقع ربط Pif1 وأن ​​مثل هذه المواقع في الخلايا الناقصة Pif1 معرضة لكسر شرائط الحمض النووي المزدوجة (52-54). يبدو أيضًا أن PIF1 البشري يعمل على pG4s (34). لقد ظهر أيضًا أنه في غياب هليكازات G-quadruplex ، يعمل عدد من نوكليازات على معالجة G-quadruplexes مما يؤدي إلى حذف G-tract. من المعروف أن نوكليازات مثل الخميرة Kem1 (55) و FEN1 البشري و EXO1 و DNA2 تشق G-quadruplexes في المختبر (56). يلعب EXO1 و FEN1 دورًا في تكرار الحمض النووي ويشاركان في صيانة التيلومير. يتسبب استنفاد هذه النيوكليزات في حدوث خلل في التيلومير (57 ، 58). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن بروتين النسخ المتماثل للربط أحادي الخيط RPA الذي يلعب دورًا مهمًا في صيانة التيلومير ، يساعد في الكشف عن G-quadruplexes عن طريق تحويل التوازن من حالة مطوية إلى حالة غير مطوية (59).

بالنسبة إلى RNA G-quadruplexes ، تأتي الأدلة المقنعة لمعالجتها في RNA واحد تقطعت بهم السبل من تحديد وتوصيف RHAU (60 ، 61) المعتمد على الـ ATP. RHAU عبارة عن هليكاز مربع DEAH يعرض نشاطًا للربط والحل لـ G4-RNA (و G4-DNA). حدد تحليل رقاقة الترسيب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP) ما يقرب من 100 من الحمض النووي الريبي المرتبط بـ RHAU في الجسم الحي واحتوت الغالبية على متواليات pG4s. أحد الأهداف هو التيلوميراز البشري RNA TER ويعتمد ارتباط RHAU على وجود بنية G4 مستقرة في منطقة 5′ من TER ، كلاهما في الجسم الحي و في المختبر (62). تتمثل العواقب الوظيفية لضربة قاضية لـ RHAU في ضعف تجميع التيلوميراز والتغيرات في طول التيلومير (63). توفر هذه البيانات دليلًا قويًا على وجود بروتينات تنظم بشكل مباشر دقة G-quadruplexes ، أو إزالتها تمامًا ، لمنع توقف شوكة النسخ المتماثل وانكسار الحمض النووي ، وطي الحمض النووي الريبي.

لم يتم توثيق الدور الإيجابي لبنى الحمض النووي والحمض النووي الريبي G-quadruplex في علم الأحياء بشكل جيد. بالإضافة إلى دورها في تحديد أصول تكرار الحمض النووي الميتازوان وفي التيلوميرات (التي تمت مناقشتها أدناه) ، فقد ظهر أنه يمكن استغلال G-quadruplexes كمواقع لإعادة تركيب الحمض النووي. أظهرت الدراسات التي أجريت على بكتيريا سالبة الجرام أن G-quadruplex ضروري ليكون بمثابة موقع بدء إعادة التركيب في الجسم الحي وهو مطلوب لتقلب مستضد البلين (64 ، 65).

G-quadruplexes عند التيلوميرات

يتم حفظ التنظيم الترادفي لتكرارات الحمض النووي التيلومري الغني بـ G عالميًا تقريبًا في حقيقيات النوى ومثل هذه التسلسلات معروفة جيدًا بتكوين G-quadruplexes في المختبر. مباشر في الجسم الحي ظهر الدليل على وجود G-quadruplexs في التيلوميرات لأول مرة منذ أكثر من 10 سنوات من الدراسات التي تستخدم أجسامًا مضادة محددة جدًا موجهة ضد G-quadruplexes (32 ، 66). أظهرت هذه الدراسات أن هيكل G-quadruplex المضاد للتوازي الجزيئي يتشكل في التيلوميرات الكبيرة النواة في Stylonychia، والأهم من ذلك أن بنية G-quadruplex يتم حلها أثناء تكرار الحمض النووي ، مما يشير إلى أن G-quadruplexes قد تعمل كهيكل سقف تيلومير (الشكل 3 أ و ب). إن الملاحظة التي مفادها أن G-quadruplex تتكشف ينظمها الفسفرة المعتمدة على دورة الخلية لبروتين رابط نهاية التيلومير TEBPβ وهليكاز شبيه بالتيلوميراز المرتبط بـ RecQ (64 ، 67 ، 68 ، 30) ، وفرت رؤية ميكانيكية مهمة في المكاني والزماني. تنظيم طي وفتح G-quadruplex للسماح بتوليف التيلومير بواسطة التيلوميراز عند الحاجة.

G-quadruplexes عند التيلوميرات. يمكن أن يشكل التراكب الغني بـ G من التيلوميرات هياكل G-quadruplex المشاركة في حماية نهاية التيلومير واستقلاب الحمض النووي التيلومير. (أ) يمكن أن يشكل البروز البشري الطويل الغني بـ G خيوطًا مطوية داخل الجزيء G-quadruplexs والتي قد توفر حماية نهائية ضد نوكليازات أو تنظم نشاط التيلوميراز. (ب) تشكل التيلوميرات الهدبية تراكيب G-quadruplex بين الجزيئات تشتمل على تيلوميرات يتم تعزيزها بواسطة بروتين رابط نهاية التيلومير TEBPβ. ترتبط التيلوميرات بهيكل نووي ثانوي (المصفوفة النووية أو السقالة) عبر تفاعل بروتين رابط نهاية التيلومير TEBPα. (ج) يؤدي تثبيت G-quadruplexes بواسطة روابط الربط G-quadruplex (النجوم الصفراء) إلى إعاقة تخليق التيلومير المتكرر بواسطة إنزيم التيلوميراز ويؤدي إلى تقصير التيلومير (المعدل بعد (80)).

G-quadruplexes عند التيلوميرات. يمكن أن يشكل التراكب الغني بـ G للتيلوميرات هياكل G-quadruplex المشاركة في حماية نهاية التيلومير واستقلاب الحمض النووي التيلومير. (أ) يمكن أن يشكل البروز البشري الطويل الغني بـ G خيوطًا مطوية داخل الجزيئي G-quadruplexs والتي قد توفر حماية نهائية ضد نوكليازات أو تنظم نشاط التيلوميراز. (ب) تشكل التيلوميرات الهدبية تراكيب G-quadruplex بين الجزيئات تشتمل على تيلوميرات يتم تعزيزها بواسطة بروتين رابط نهاية التيلومير TEBPβ. ترتبط التيلوميرات بهيكل نووي ثانوي (المصفوفة النووية أو السقالة) عبر تفاعل بروتين رابط نهاية التيلومير TEBPα. (ج) يؤدي تثبيت G-quadruplexes بواسطة روابط الربط G-quadruplex (النجوم الصفراء) إلى إعاقة تخليق التيلومير المتكرر بواسطة إنزيم التيلوميراز ويؤدي إلى تقصير التيلومير (المعدل بعد (80)).

بالنسبة للتيلوميرات البشرية ، فإن أول إشارة إلى احتمال وجود G-quadruplexes جاءت من الملاحظة التي مفادها أن روابط G-quadruplex المستقرة تضعف استقلاب التيلومير وتؤدي إلى تقصير التيلومير (الشكل 3C) (69-71). استند هذا النهج إلى ملاحظة أن التيلوميرات G-quadruplexes تثبط نشاط التيلوميراز (72). يتوفر الآن عدد من روابط تثبيت G-quadruplex وقد أصبح من الواضح أن العديد منها لا يستهدف إنزيم التيلوميراز ، ولكن التيلومير نفسه (73-75). تضمنت الطرق الأخرى لتحديد G-quadruplexes في التيلوميرات البشرية ربط يجند G-quadruplex الموسوم إشعاعيًا بالكروموسومات الطورية (76) ، واستخدام صبغة السيانين الفلورية (77) ، ومؤخراً ، استخدام بنية هندسية - أجسام مضادة محددة ضد الانعكاسات G-quadruplexes البشرية (78 ، 79). في جميع الحالات ، تم الكشف عن إشارات في نهايات الكروموسومات ، وإن لم تكن كلها نهايات. دقة الفحص المجهري للضوء ليست عالية بما يكفي لفك ما إذا كان الارتباط قد حدث في نهاية الكروموسوم أو في المناطق الفرعية التيلوميرية ، والمعروف أيضًا بتبني هياكل G-quadruplex في المختبر (80). لهذه الأسباب ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت G-quadruplexes موجودة في التيلوميرات البشرية. ومع ذلك ، فإن اكتشاف عدد من طائرات الهليكوبتر المعروفة بفك G-quadruplexs في المختبر (مثل RecQ Helicases WRN و BLM) ، توضع في التيلوميرات وتكون مطلوبة لتكامل التيلومير في الجسم الحي، تقدم أدلة ظرفية قوية على وجود مثل هذه الهياكل في التيلوميرات في الثدييات (81 ، 82 ، 30 ، 45 ، 83 ، 84).

يبدو أن الوظيفة الأساسية لطائرات WRN و BLM هي ضمان التكرار المناسب للحمض النووي التيلومري من خلال مساعدة عوائق G-quadruplex الفك (الشكل 5). إن هليكاز WRN ضروري لمنع فقدان التيلومير الدراماتيكي أثناء التكاثر المتأخر للخيط الغني بـ G وما يترتب على ذلك من تراكم انحرافات الكروموسوم مثل اندماج الكروموسوم (85). تقوم WRN بالتجميع والتفاعل الجسدي مع بروتينات ربط التيلومير الحرجة TRF2 و POT1 (86) ويرتبط كل من WRN و BLM بتقارب كبير مع POT1 (87) ، مما يشير إلى أن البروتينات التيلوميرية المرتبطة بالحمض النووي قد تعمل في توظيف الهليكس. تظهر الخلايا الناقصة في RETL1 هشاشة التيلومير (50 ، 81) ، والتي يتم تعزيزها بواسطة عامل استقرار G-quadruplex TMPyP4. يشير هذا مرة أخرى إلى أن G-quadruplexes تتشكل عند التيلوميرات وإذا لم يتم حلها فإنها تؤدي إلى تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، يبدو أن دور RETL1 أكثر عمومية في مساعدة جينوم النسخ المتماثل على نطاق واسع لأنه يتفاعل مباشرة مع مشبك النسخ المتماثل PCNA (49).

G-quadruplexes في النسخ والترجمة

إن الاكتشاف الذي يشير إلى أن حوالي 50 ٪ من الجينات البشرية تحتوي على pG4s بالقرب من مناطق المروج لها يشير إلى دور G-quadruplexes في تنظيم التعبير الجيني (الشكل 4 أ). ومن المثير للاهتمام ، أن pG4s أكثر تواترًا في الجينات المسرطنة أو الجينات التنظيمية عنها في التدبير المنزلي ، أو الجينات الكابتة للورم (88 ، 89) ، (للمراجعة (9 ، 84)). جاء الدليل الأول على أن pG4s في المروجين (الشكل 4 أ) لها تأثير على التعبير الجيني من دراسات على الجين الورمي c-MYC ، حيث تبين أن طفرات pG4 ، أو إضافة G-quadruplex المستقرة يجند أثرت على النسخ في الجسم الحي (90 ، 91). بشكل أكثر إقناعًا ، تُظهر دراسات التعبير الجيني الواسع للجينوم في الخميرة والخلايا البشرية تغيرات في العديد من الجينات بعد إضافة يجند الربط G-quadruplex TMPyP4 وبشكل ملحوظ ، تم إثراء الجينات التي تأثر تعبيرها في pG4s (الشكل 4 أ) (92 ، 93) . أظهرت الدراسات التي أجريت باستخدام جسم مضاد أحادي السلسلة G-quadruplex تغيرات في التعبير الجيني للجينات التي تحتوي على pG4s ولم يقتصر التأثير على المحفزات فقط ولكن أيضًا على pG4s في نهايات الجينات ، مما يشير إلى احتمال تورط G-quadruplexes في كل من النسخ. بدء وإنهاء (94 ، 95). علاوة على ذلك ، أظهر تحليل الجينوم الواسع للخلايا البشرية أن مواقع الربط الخاصة بالنسخ المرتبطة بالنسخة XPB و XPD تتداخل بشكل كبير مع pG4s. نظرًا لأن هذه المروحيات ترتبط بـ G-quadruplexes وتكشف عنها ، فمن المحتمل أن يتم تجنيدها في G-quadruplexes في الجينوم للمساعدة في النسخ (96).

G-quadruplexes في النسخ والترجمة. (أ) توجد تسلسلات pG4 في حوالي 50٪ من محفزات الجينات البشرية. يمكن أن يؤدي تكوين G-quadruplex إلى إعاقة بدء النسخ بواسطة بوليميريز RNA ، أو إذا كان موجودًا في الخيط المضاد للاندماج يمنع النسخ. (ب) يمكن أن يؤدي وجود G-quadruplexes المتكونة في 5 ′ UTR من mRNAs إلى تنظيم الترجمة وكذلك يؤدي إلى نسخ نسخ RNA المجهضة في أمراض التوسع المتكرر سداسي النوكليوتيد.

G-quadruplexes في النسخ والترجمة. (أ) توجد تسلسلات pG4 في حوالي 50٪ من محفزات الجينات البشرية. يمكن أن يؤدي تكوين G-quadruplex إلى إعاقة بدء النسخ بواسطة بوليميريز RNA ، أو إذا كان موجودًا في الخيط المضاد للاندماج يمنع النسخ. (ب) يمكن أن يؤدي وجود G-quadruplexes المتكونة في 5 ′ UTR من mRNAs إلى تنظيم الترجمة وكذلك يؤدي إلى نسخ نسخ RNA المجهضة في أمراض التوسع المتكرر سداسي النوكليوتيد.

كشفت الدراسات على نطاق الجينوم أيضًا أن pG4s غنية بالتخصيب في مواقع فرط الحساسية DNaseI (97) وترتبط بانخفاض إشغال النواة (93). وبالتالي ، يمكن أن تؤثر pG4s على ترسيب البروتينات التنظيمية و / أو تغيير بنية الكروماتين وثباته. يتم إبراز الرابط بين G-quadruplexes والكروماتين من خلال معيد تشكيل الكروماتين ATRX (ثلاسيميا ألفا / التخلف العقلي المرتبط بـ X) والذي يعمل مع شريكه المتفاعل DAXX كمركب هيستون تشابيرون في ترسب متغير هيستون H3.3 ، وبالتالي استقرار الكروماتين (98). يتم ترجمة ATRX إلى تيلوميرات متغايرة حول المركز والتيلوميرات ، وكشفت التحليلات على مستوى الجينوم في الفئران والخلايا البشرية أنها ترتبط بالتسلسلات الغنية بالـ GC والتي يكون جزء مهم منها هو pG4s. في المختبر تم عرض ATRX لربط G-quadruplexes (99). تؤثر الطفرات المسببة للأمراض في ATRX على مجموعة متنوعة من العمليات النووية الأساسية ، بما في ذلك النسخ. ترتبط متلازمة ATRX بالثلاسيميا ، والتي تُعزى إلى التنظيم السفلي لـ α-globin من خلال ربط ATRX بـ pG4s المتكرر في أعلى الجين. ومن المثير للاهتمام ، أن كلاً من القرب وطول العدد المتغير المتكرر المتكرر بالترادف أثر على شدة إسكات الجينات ، مما يشير إلى سبب مباشر لـ pG4s. بدلاً من ذلك ، بناءً على الملاحظات من دراسات النسخ المتماثل في خلايا DT40 للطيور (100 ، 101) ، استنتج أن إسكات النسخ حدث عبر تكرار الحمض النووي المعوق G-quadruplex (الشكل 5) مما يؤثر على النسخ من خلال الميراث غير المناسب لعلامات هيستون اللاجينية. ومن المثير للاهتمام أن عدم الاستقرار الوراثي فوق الجيني يمكن أن ينشأ من G-quadruplex الموجود على مسافة تصل إلى 3500 زوجًا أساسيًا من موقع بدء النسخ (13). على الرغم من أن هذه الملاحظات تقدم أدلة دامغة على تورط pG4s في تنظيم التعبير الجيني في الجسم الحيلا يزال يتعين إثبات ما إذا كانت آلية تنظيم النسخ مباشرة من خلال تشكيل G-quadruplex. إذا كان تكوين G-quadruplex هو الآلية ، فيجب أن يختلف حدوثها (وتنظيمها) بين مختلف الخلايا المتمايزة.

G-quadruplexes والنسخ المتماثل. تتشكل G-quadruplexes أثناء النسخ المتماثل عندما يكون الحمض النووي منفردًا بشكل عابر يعيق التكرار ويجب حله للسماح بآلية النسخ المتماثل بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي للمضي قدمًا في كل من تخليق DNA الخيطي الرئيسي والمتأخر. من المعروف أن G-quadruplexes يتم حلها بواسطة مروحيات فك اللفة G-quadruplex مثل FANCJ التي لها اتجاه 5′ – 3. هليكازات أخرى مثل BLM و WRN لها اتجاهية 3′ –5. تعمل البروتينات أو الإنزيمات الأخرى مثل البوليميرات أيضًا في الالتفاف الناجح لـ G-quadruplexes.

G-quadruplexes والنسخ المتماثل. تتشكل G-quadruplexes أثناء النسخ المتماثل عندما يكون الحمض النووي منفردًا بشكل عابر يعيق التكرار ويجب حله للسماح بآلية النسخ المتماثل بما في ذلك بوليميريز الحمض النووي للمضي قدمًا في كل من تخليق DNA الخيطي الرئيسي والمتأخر. من المعروف أن G-quadruplexes يتم حلها بواسطة مروحيات فك اللفة G-quadruplex مثل FANCJ التي لها اتجاه 5′ – 3. هليكازات أخرى مثل BLM و WRN لها اتجاهية من 3 إلى 5 درجات. تعمل البروتينات أو الإنزيمات الأخرى مثل البوليميرات أيضًا في الالتفاف الناجح لـ G-quadruplexes.

كشفت التنبؤات الحسابية أن RNA pG4s موجودة أيضًا في المنطقة غير المترجمة 5 (UTR) للعديد من الجينات وقد تم إثبات مشاركة G-quadruplexes في تنظيم الترجمة من خلال في المختبر و في الجسم الحي دراسات (الشكل 2 د) (24). منذ أكثر من عقد من الزمان ، اقترحت الدراسات الرائدة حول التخلف العقلي الهش X ، الناشئ عن توسع التكرار (CGG) ، أولاً أن G-quadruplexes في mRNA كانت متورطة في الوظيفة العصبية (102) وكانت هدفًا لبروتين التخلف العقلي FMRP. يرتبط FMRP على وجه التحديد بـ mRNA الخاص به من خلال G-quadruplex الموجود في 5 ′ UTR ، مما يعيق الترجمة مما يؤدي إلى تغيير ملفات تعريف mRNA متعدية الدماغ (103). كشف تحقيق حديث حول دور RNA helicase eIF4A ، باستخدام بصمة الريبوسوم لتوفير لقطات من الترجمة عبر النص ، أن السمة المميزة للنصوص المعتمدة على eIF4A هي توقيع 12 نيوكليوتيد pG4 (CGG)4 التي يمكن أن تشكل هياكل RNA G-quadruplex (104). يعزز eIF4A ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية عن طريق المساعدة في ترجمة mRNAs مع UTRs الطويلة والمعقدة. ومن ثم ، فإن هذه النتائج تورط RNA G-quadruplexes في تنظيم ترجمة عدد من الجينات المسرطنة (الشكل 4 ب) (104). بالإضافة إلى ذلك ، تم إثبات أن pG4 في 3 UTR لبعض الرنا المرسال متورط في مادة عديد الأدينيل البديلة وتقصير النصوص (25).

الأدلة المباشرة على البروتينات التي تربط وتحلل RNA G-quadruplexes ضئيلة ، باستثناء الدراسات الحديثة على RHAU هيليكس RNA. تم إثبات أن هذا الإنزيم المعتمد على ATP يرتبط بتقارب وخصوصية عالية العديد من RNAs التي تحتوي على pG4s بما في ذلك telomerase RNA TER ، ويحل G-quadruplexes في المختبر (60 ، 62). تؤدي الطفرات في pG4 في TER إلى ظهور نمط ظاهري تيلومري (105). بالإضافة إلى ذلك ، كما هو مذكور أعلاه ، فإن G-quadruplexes التي تتشكل في m-RNA الناشئة عن توسع تكرار hexanucleotide (GGGGCC) n تؤدي إلى نسخ RNA المجهضة واضطراب معالجة RNA (44).

تكرار التيلومير الطويل الغني بـ G المحتوي على الحمض النووي الريبي (TERRA) الناتج عن نسخ الحمض النووي التيلومري للإنسان والخميرة (106 ، 107) يتبنى بشكل غير مفاجئ هياكل G-quadruplex في المختبر ( 26, 108). في المختبر أظهرت الدراسات أن البروتين المرتبط بالتيلومير في الثدييات TRF2 يمكن أن يتفاعل مع TERRA G-quadruplexes ، مما قد يشير إلى دور في تنظيم التيلومير (39). بالنظر إلى الذخيرة الهيكلية العظيمة للـ RNAs ، فمن المحتمل أن تظهر أدوار إضافية لـ RNA G-quadruplexes (وغيرها من الهياكل العليا) في العمليات التنظيمية.

G-quadruplexes في التكرار وعدم استقرار الجينوم

يبدو أن لدنا DNA G-quadruplexs دورًا مزدوجًا في تنظيم تكرار الحمض النووي: كعوائق أمام التكرار الذي يؤدي في الخلفيات المتحولة إلى عدم استقرار الجينوم ، وكمكونات لأصول النسخ المتماثل للميتازوان (الشكلان 5 و 6).

G-quadruplexes وبدء تكرار الحمض النووي. أصول التكاثر في الفئران والبشر غنية بـ GC وتحتوي على pG4s. يتطلب تكوين G-quadruplex لبدء تكرار الحمض النووي وتحديد موقع G-quadruplex (المعدل بعد (117)).

G-quadruplexes وبدء تكرار الحمض النووي. أصول التكاثر في الفئران والبشر غنية بـ GC وتحتوي على pG4s. يتطلب تكوين G-quadruplex لبدء تكرار الحمض النووي وتحديد موقع G-quadruplex (المعدل بعد (117)).

هناك أدلة متزايدة على أن كلاً من بوليمرات الدنا المتخصصة وهليكازات تعمل في تكرار G-quadruplexes لمنع عدم الاستقرار الوراثي والجيني (الشكل 5) (45 ، 109). ظهرت رؤى ثاقبة حول دور هليكازات G-quadruplex في تكرار الحمض النووي من الدراسات حول متلازمات عدم استقرار الجينوم التي تسببها طفرات فقدان الوظيفة في واحدة أو أخرى من هذه الهليكازات (الشكل 5 أ). في C. ايليجانس تحتوي على فقدان طفرة وظيفية في جين DOG-1 ، تتراكم عمليات الحذف في المناطق الجينومية التي تحتوي على pG4s (46). الدراسات التي أجريت على طائرات الهليكوبتر الأخرى ، على سبيل المثال FANCJ و WRN و BLM و Pif1 ، تدعم هذه النتائج وتوسعها. بينما يبدو أن هليكاز WRN مطلوب بشكل أساسي لتكرار الحمض النووي التيلومير ، بما يتوافق مع مرضى متلازمة ويرنر (الذين لديهم طفرات في WRN هيليكاز) الذين يظهرون الشيخوخة المبكرة وتقصير التيلومير المتسارع. تعمل FANCJ بالإضافة إلى Pif1 أو BLM أيضًا في المناطق الجينية الداخلية وهي مطلوبة لسلامة الجينوم (45 ، 109). تؤدي الطفرات في هليكوبتر FANCJ إلى عمليات حذف كبيرة ترتبط بـ pG4s في الجينوم (48). العرض التوضيحي الذي يوضح أن FANCJ تفكك بشكل تفضيلي G-quadruplexes في المختبر اقترح أن تعمل طائرة FANCJ مثل DOG1 عن طريق حل G-quadruplexes التي تشكلت أثناء النسخ المتماثل (الشكل 5 ب). في الجسم الحي دليل على توقف شوكة النسخ المتماثل الناجم عن pG4s جاء من دراسة أنيقة في خط خلية DT40 للطيور ناقص في بوليميراز translesion REV1 (100). في هذه الدراسة ، تم تعيين مواقع الشوكات المتوقفة على pG4s وأظهر المؤلفون أيضًا أن التوقف كان بسبب وجود تسلسل تشكيل G-quadruplex ، وليس تسلسل G-rich. بشكل ملحوظ ، وجد أن الفشل في الحفاظ على تكرار الحمض النووي يؤدي إلى فك اقتران تخليق الحمض النووي وإعادة تدوير الهيستون ، علاوة على أن عدم الاستقرار اللاجيني المرتبط بـ pG4 يرجع إلى طفرات في ثلاث مروحيات متورطة في تفكيك هياكل G-quadruplex (FANCJ ، WRN و BLM) (100 ، 101). توفر الملاحظات الحديثة أيضًا دليلًا مباشرًا على لعب ATRX دورًا في مساعدة النسخ المتماثل. تسبب الخلل الوظيفي في ATRX في حدوث عيوب في النسخ المتماثل وزيادة عدد آليات الاستجابة لتلف الحمض النووي في التيلوميرات في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (110). هذه الملاحظة التي تم جمعها مع معرفة أن ATRX تستهدف pG4s (97) ، تشير إلى أنه في هذه الحالة أيضًا يمكن أن تكون G-quadruplexes هي السبب في توقف شوكة النسخ المتماثل. تم تحديد الطفرات في ATRX البشري مؤخرًا في الأورام التي تحافظ على التيلوميرات الخاصة بها من خلال مسار مستقل عن التيلوميراز (الإطالة البديلة للتيلوميرات (ALT)) الذي يتضمن إعادة التركيب المتماثل ، مما يشير إلى وجود عيوب في النسخ المتماثل في التيلوميرات في خلايا ALT (111). وقد جاء الدليل على عدم استقرار الجينوم الناتج عن التكرار المعيب أيضًا من الدراسات التي أجراها الساتل البشري الصغير الفرعي CBE1 ، والذي يشكل بنية G-quadruplex في المختبر (80) ، في جينوم الخميرة الناقصة Pif1 (52 ، 54). وقد تبين كذلك أن النسخ المتماثل تباطأ بالقرب من pG4s وأن كسر الحمض النووي حدث في هذه المواقع في نقص Pif1 S. cerevisiae. بشكل مقنع لدور Pif1 في حل G-quadruplexes ، يمكن قمع تكسر الحمض النووي المرتبط بـ G-quadruplex عن طريق التعبير خارج الرحم لـ Pif1 (51 ، 112). وبالمثل ، في الدراسة التي أجريت باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد G-quadruplexes (78) ، تبين أن عدد بؤر تلف الحمض النووي زاد بشكل ملحوظ خلال المرحلة S ، مما يشير إلى أن البؤر تمثل G-quadruplexes التي تشكلت أثناء النسخ المتماثل. في حين أن هذا قد يكون صحيحًا ، فإن التوطين المشترك لهذه البؤر مع الحمض النووي المركب حديثًا من شأنه أن يعزز الاستنتاج (78).

أدى الحجم الكبير لجينومات الميتازوان ، حيث يحدث النسخ المتماثل من حوالي 30000-50000 من أصل النسخ المتماثل في الخلايا البشرية أو الفأرية (وربما تحتوي على 10 أضعاف الأصول المحتملة على الأقل) ، إلى منع التعرف عليها لسنوات عديدة. ومع ذلك ، فإن التحليلات المحسنة على نطاق الجينوم للمواقع النشطة لبدء تكرار الحمض النووي أصبحت الآن قادرة على معالجة خصوصية التسلسل لأصول النسخ المتماثل. على عكس تسلسلات الإجماع الثرية AT الخاصة بالأصول في S. cerevisiae، 80-90 ٪ من جميع الأصول في خلايا الفئران والبشر تحتوي على مناطق غنية بالـ GC تشكل عناصر متكررة غنية بالـ G (الشكل 6) (19 ، 21 ، 113). يتم الحفاظ على ميزة GC الغنية هذه في أصول النسخ المتماثل للنباتات (114). تتميز عناصر التسلسل هذه بالسمات المميزة لتسلسلات تكوين G-quadruplex ، وقد تكون هذه الهياكل أكثر أهمية من خصوصية التسلسل لتمييز بدء تكرار الحمض النووي من أي من حبلا DNA (الشكل 6) (115). لقد قيل مؤخرًا أن التكرار المرتفع لـ pG4 في الأصول قد يكون مبالغًا فيه بسبب الهضم غير الفعال لهيكل G-quadruplex بواسطة نوكلياز خارجي المستخدم في رسم الخرائط (116). ومع ذلك ، تظهر البيانات التجريبية المقنعة أن G-quadruplex مطلوب بالفعل لبدء النسخ المتماثل في الجسم الحي (117). ومع ذلك ، لا يزال يتعين فهم كيفية اختيار أصول النسخ المتماثل المحتملة داخل النسخ المتماثل للتنشيط في أنواع الخلايا المختلفة وقد تتضمن الحديث المتبادل بين الجينوم وتنظيم الكروماتين والنسخ والنسخ (115 ، 118). هذه البيانات ليست مهمة فقط لفهمنا للتحكم في تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى الأعلى ، ولكن قد يكون لها تأثير على العلوم التطبيقية من خلال السماح ببناء نواقل تكرار ذاتيًا لاستخدامها في العلاج الجيني والخلايا الجذعية.


التحميل الان!

لقد سهلنا عليك العثور على كتب إلكترونية بتنسيق PDF دون أي حفر. ومن خلال الوصول إلى كتبنا الإلكترونية عبر الإنترنت أو عن طريق تخزينها على جهاز الكمبيوتر الخاص بك ، لديك إجابات مناسبة مع الفصل 18 من تنظيم إجابات التعبير الجيني. للبدء في العثور على الفصل 18 من تنظيم إجابات التعبير الجيني ، فأنت محق في العثور على موقعنا الإلكتروني الذي يحتوي على مجموعة شاملة من الأدلة المدرجة.
مكتبتنا هي الأكبر من بين هذه المكتبات التي تحتوي على مئات الآلاف من المنتجات المختلفة الممثلة.

أخيرًا حصلت على هذا الكتاب الإلكتروني ، شكرًا على كل هذه الإجابات عن تنظيم الفصل 18 من إجابات التعبير الجيني التي يمكنني الحصول عليها الآن!

لم أكن أعتقد أن هذا سيعمل ، أظهر لي أفضل أصدقائي هذا الموقع ، وهو يعمل! أحصل على الكتاب الإلكتروني المطلوب

wtf هذا الكتاب الاليكترونى الرائع مجانا ؟!

أصدقائي غاضبون جدًا لدرجة أنهم لا يعرفون كيف أمتلك كل الكتب الإلكترونية عالية الجودة التي لا يعرفون عنها!

من السهل جدًا الحصول على كتب إلكترونية عالية الجودة)

الكثير من المواقع المزيفة. هذا هو أول واحد نجح! تشكرات

wtffff أنا لا أفهم هذا!

ما عليك سوى اختيار النقر ثم زر التنزيل ، وإكمال العرض لبدء تنزيل الكتاب الإلكتروني. إذا كان هناك استبيان يستغرق 5 دقائق فقط ، فجرب أي استطلاع يناسبك.


شاهد الفيديو: علم الاحياء الجزيئي المحاضرة السادسة الجزء العاشر (كانون الثاني 2022).