معلومة

كريسبر-كاس 9 بالضربة القاضية


باستخدام CRISPR-Cas9 ، أجريت ضربة قاضية مستهدفة لمنطقة DNA ترميز بروتينًا معينًا (يعمل مع الكريات البيض). سؤالي هو ، كم من الوقت يستغرق حتى لا يتم اكتشاف هذا البروتين بعد الآن (على سبيل المثال عن طريق تلطيخ السطح + قياس التدفق الخلوي) بعد التلاعب بالحمض النووي؟ أو بعبارة أخرى: كم مرة يتم النسخ والترجمة وما إلى ذلك؟


للإجابة على سؤالك العديد من المعلمات التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار.

هناك مجموعتان رئيسيتان من المعلمات: محددة الجينات و خط خلية محددة.

المعلمات المتعلقة بجين اهتمامك المحدد:

  • هل تعرف نصف عمر الحمض النووي الريبي للجين الذي يهمك؟ معظم الوقت غير معروف ولكن هناك العديد من الأدوات والموارد التي يمكن أن تتنبأ بها بناءً على الكثير من الميزات المختلفة مثل الأطوال والثبات 3'UTR ، 5'UTR ، عدد exons introns ، إلخ. يوجد بالفعل أشخاص قاموا إما بإجراء اضطراب وراثي (سيرنا ، كريسبر ، إلخ) أو فحص تدهور. في هذه الحالة ، قد تكون قادرًا على تخمين ما هو نصف العمر النسبي للحمض النووي الريبي أو البروتين.
  • وهو ما يقودنا إلى عمر النصف للبروتين الذي يهمنا. تميل البروتينات القابلة للذوبان عمومًا إلى أن يكون لها عمر نصف أصغر من البروتينات الغشائية (ليس ضروريًا ، هناك استثناءات). على سبيل المثال ، قد يكون إجراء ضربة قاضية وظيفية كاملة لعامل النسخ أسهل من مستقبل GPCR. إذا كان بروتينًا غشائيًا ، فما هي العضية التي يتم توطينها؟ هل تقوم العضية بإعادة تدوير الغشاء كثيرًا أم أن الخلية تنقسم؟ في هذه الحالة ، قد يكون لديك فرص في أن البروتينات القابلة للحياة الموجودة قبل الاضطراب الجيني تضعف. في هذه الأمثلة ، قد تحصل على بروتين قابل للذوبان في أقل من 24-48 ساعة ، بينما قد يستغرق البروتين الغشائي المستقر جدًا من 7 إلى 10 أيام.
  • عدد نسخ الحمض النووي الريبي مهم وكذلك العدد المرتبط بالريبوسومات (أقل أهمية) وتوطينها في الخلية (أقل أهمية)
  • وفرة البروتين بشكل عام.

المعلمات المتعلقة بخط اهتماماتك الخلوية:

  • نسب خط الخلية الذي حددته: خطوط الخلايا المختلفة لها معدلات نسخ وترجمة عالمية مختلفة.
  • معدل انقسام خط الخلية (معلمة مهمة للغاية): كلما كان الخط الخلوي ينقسم بشكل أسرع كلما زادت سرعة نسخ الرنا المرسال التي لم تتعرض للاضطراب (النوع البري) وسيتم تخفيف البروتينات الموجودة قبل الاضطراب الجيني بين الخلايا الوليدة.
  • عدد النسخ في خط الخلية: إذا كانت هناك نسخ متعددة من الجين الذي يهمك ، فستحتاج إلى التأكد من أن كل نسخة من الجين قد تعرضت للاضطراب لتؤدي إلى KO وظيفي.
  • الاستقرار الجيني لخط الخلية: بعض خطوط الخلايا مثل هيلا معروفة تمامًا بعدم الاستقرار الجيني حيث يمكن إعادة ترتيب الكثير من الجينوم ويمكن إصلاح النسخ المضطربة باستخدام نسخ قابلة للتطبيق

أخيرًا وليس آخرًا ، يعتمد الأمر تقنيًا على كيفية قيامك باضطراب CRISPR-Cas9 الوراثي: ترنسفكأيشن من جرنا ، والتثقيب الكهربائي لـ Cas9 مع جرنا ، والتسليم بوساطة الفيروسة البطيئة ، إلخ. الوقت الذي قدمته هو بعد تسليم جميع المكونات و موجودة بكميات كبيرة في النواة.

أتمنى أن يساعد ذلك!


محتويات

الدراسات المبكرة في أنواع معينة انيقة [1] و ذبابة الفاكهة سوداء البطن [2] [3] شهدت شاشات فقدان الوظيفة المنتظمة على نطاق واسع (LOF) التي تم إجراؤها من خلال طفرات التشبع ، مما يدل على إمكانات هذا النهج في توصيف المسارات الوراثية وتحديد الجينات ذات الوظائف الفريدة والأساسية. تم تطبيق تقنية الطفرات في التشبع لاحقًا في الكائنات الحية الأخرى ، على سبيل المثال سمك الزرد [4] [5] والفئران. [6] [7]

ظهرت الأساليب المستهدفة لضربة قاضية للجينات في الثمانينيات باستخدام تقنيات مثل إعادة التركيب المتماثل ، [8] [9] الريبوزيمات العابرة للانقسام ، [10] [11] والتقنيات المضادة للحساسية. [12] [13]

بحلول عام 2000 ، ظهرت تقنية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كتقنية سريعة وبسيطة وغير مكلفة لضربة قاضية للجينات المستهدفة ، وكانت تُستخدم بشكل روتيني للدراسة في الجسم الحي وظيفة الجين فيها C. ايليجانس. [14] [15] [16] [17] في الواقع ، في غضون بضع سنوات فقط بعد اكتشافه بواسطة Fire وآخرون. (1998) ، [18] تقريبًا كل من

19000 جين في C. ايليجانس تم تحليلها باستخدام ضربة قاضية قائمة على RNAi. [19]

سهّل إنتاج مكتبات RNAi تطبيق هذه التقنية على نطاق الجينوم الواسع ، وأصبحت الأساليب القائمة على RNAi هي النهج السائد لشاشات الضربة القاضية على مستوى الجينوم. [ بحاجة لمصدر ]

ومع ذلك ، فإن الأساليب القائمة على RNAi لشاشات ضربة قاضية على مستوى الجينوم لها حدودها. أولاً ، تسبب التأثيرات العالية خارج الهدف مشكلات في الملاحظات الإيجابية الكاذبة. [20] [21] بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن RNAi يقلل من التعبير الجيني في مستوى ما بعد النسخ عن طريق استهداف RNA ، فإن الشاشات القائمة على RNAi تؤدي فقط إلى قمع جزئي وقصير المدى للجينات. في حين أن الضربة القاضية الجزئية قد تكون مرغوبة في مواقف معينة ، إلا أن هناك حاجة إلى تقنية ذات كفاءة استهداف محسنة وتأثيرات أقل خارج الهدف. [ بحاجة لمصدر ]

منذ التعرف الأولي على أنه جهاز مناعي تكيفي بدائي النواة ، [22] أصبح النوع الثاني من البكتيريا المتجمعة بانتظام متناظرة قصيرة (CRISPR) / نظام Cas9 أداة بسيطة وفعالة لتوليد طفرات LOF المستهدفة. [23] تم تطبيقه بنجاح لتحرير الجينوم البشري ، وبدأ في إزاحة RNAi كأداة مهيمنة في دراسات الثدييات. [24] في سياق شاشات خروج المغلوب على مستوى الجينوم ، أظهرت الدراسات الحديثة أن شاشات CRISPR / Cas9 قادرة على تحقيق استنفاد كامل للبروتين بكفاءة عالية ، والتغلب على المشكلات غير المستهدفة التي تظهر مع شاشات RNAi. [25] [26] باختصار ، أدى ظهور CRISPR-Cas9 مؤخرًا إلى زيادة قدرتنا بشكل كبير على أداء شاشات LOF واسعة النطاق. إن تعدد الاستخدامات وقابلية البرمجة في Cas9 ، إلى جانب الضوضاء المنخفضة والكفاءة العالية بالضربة القاضية والحد الأدنى من التأثيرات غير المستهدفة ، جعلت من CRISPR النظام الأساسي المفضل للعديد من الباحثين المشاركين في استهداف الجينات وتحريرها. [24] [27]

CRISPR / Cas9 فقدان وظيفة التحرير

نظام التكرارات المتناظرة القصيرة المُجمَّعة بانتظام (CRISPR) / نظام Cas9 عبارة عن تقنية لتحرير الجينات يمكنها تقديم فواصل مزدوجة الشرائط (DSBs) في موضع جينومي مستهدف. باستخدام دليل واحد RNA (sgRNA) ، يمكن توصيل نوكلياز Cas9 الداخلي إلى تسلسل DNA محدد حيث يشق سلسلة النيوكليوتيدات. [28] يتم تحديد خصوصية sgRNA من خلال تسلسل 20-nt ، متماثل مع موضع الاهتمام الجيني ، ويتم التوسط في الارتباط بـ Cas9 بواسطة منطقة سقالة ثابتة من sgRNA. يجب أن يتبع الموقع الهدف المطلوب على الفور (5 "إلى 3") بواسطة شكل مجاور محفوظ لـ 3 نيوكليوتيدات بروتوسفاسر (PAM). [29] [30] من أجل إصلاح DSBs ، قد تستخدم الخلية الانضمام غير المتماثل المعرض للخطأ بدرجة عالية ، أو إعادة التركيب المتماثل. من خلال تصميم sgRNAs المناسبة ، يمكن إدخال عمليات الإدراج أو الحذف المخطط لها في الجينوم. في سياق شاشات LOF على مستوى الجينوم ، فإن الهدف هو التسبب في تعطيل الجينات والضربة القاضية. [ بحاجة لمصدر ]

تحرير مكتبات sgRNA

إنشاء مكتبة التحرير

لإجراء عمليات الضربة القاضية لـ CRISPR على نطاق الجينوم ، يجب إنشاء مجموعات من sgRNAs المعروفة باسم مكتبات sgRNA ، أو مكتبات خروج المغلوب CRISPR. تتمثل الخطوة الأولى في إنشاء مكتبة sgRNA في تحديد المناطق الجينومية ذات الأهمية بناءً على قواعد استهداف sgRNA المعروفة. [31] على سبيل المثال ، تكون sgRNAs أكثر فاعلية عند استهداف مناطق ترميز الجينات وليس UTRs 5 و 3. تمثل exons المحفوظة أهدافًا جذابة ، ويجب مراعاة الموضع المتعلق بموقع بدء النسخ. [31] ثانيًا ، تم تحديد واختيار جميع مواقع حزب الأصالة والمعاصرة الممكنة. [31] يجب تحليل النشاط داخل وخارج الهدف ، وكذلك محتوى GC ، ويجب تجنب امتدادات البوليمر المتجانس. [31] نوكلياز Cas9 الداخلي الأكثر استخدامًا ، مشتق من الأبراج العقدية، يتعرف على تسلسل PAM من NGG. [32]

علاوة على ذلك ، يبدو أن النيوكليوتيدات المحددة مفضلة في مواقع محددة. يُفضل الجوانين بشدة على السيتوزين في الموضع 20 بجوار نموذج PAM مباشرةً ، وفي الموضع 16 يُفضل السيتوزين على الجوانين. [33] بالنسبة للنيوكليوتيدات المتغيرة في شكل NGG PAM ، فقد تبين أن السيتوزين مفضل وأن الثايمين غير مرغوب فيه. [33] مع أخذ هذه المعايير في الاعتبار ، تم تصميم مكتبة sgRNA حسابيا حول مواقع PAM المختارة. [31] [33] [34]

يجب إنشاء sgRNAs متعددة (على الأقل 4-6) ضد كل جين واحد للحد من الكشف الإيجابي الكاذب ، ويجب تضمين sgRNAs الضابطة السلبية مع عدم وجود أهداف معروفة. [31] [33] ثم يتم إنشاء sgRNAs بواسطة فى الموقع التوليف ، تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، واستنساخه في نظام توصيل ناقل.

تحرير المكتبات الموجودة

يعد تطوير مكتبة sgRNA جديدة عملية شاقة وتستغرق وقتًا طويلاً. في الممارسة العملية ، يمكن للباحثين اختيار مكتبة موجودة بناءً على الغرض التجريبي وخطوط الخلايا التي تهمهم. اعتبارًا من فبراير 2020 ، كانت أكثر الموارد المستخدمة على نطاق واسع لشاشات خروج المغلوب CRISPR على مستوى الجينوم هي مكتبتي Genome-Scale CRISPR Knock-Out (GeCKO) التي أنشأها مختبر Zhang. [35] تتوفر من خلال addgene ، وتستهدف هذه المكتبات lentiviral على التوالي exons الإنسان والفأر ، وكلاهما متاح كنظام متجه واحد (حيث توجد sgRNAs و Cas9 على نفس البلازميد) أو كنظام ثنائي الاتجاه (حيث توجد sgRNAs و Cas9 على بلازميدات منفصلة). يتم تسليم كل مكتبة على شكل مكتبتين نصفيتين ، مما يسمح للباحثين بفحص 3 أو 6 sgRNAs / جين. [36]

بصرف النظر عن GeCKO ، تم إنشاء عدد من مكتبات CRISPR الأخرى وإتاحتها من خلال addgene. تحتوي مختبرات Sabatini & amp Lander حاليًا على 7 مكتبات بشرية وفأرية منفصلة ، بما في ذلك مكتبات فرعية مستهدفة للوحدات الفرعية المتميزة مثل كينازات وجينات الريبوسوم (Addgene # 51043–51048). علاوة على ذلك ، أدت التحسينات التي أدخلت على خصوصية sgRNAs إلى مكتبات "الجيل الثاني" ، مثل مكتبات Brie (Addgene # 73632) و Brunello (Addgene # 73178) التي تم إنشاؤها بواسطة مختبرات Doench and Root ، ومكتبة Toronto (TKO) (Addgene # 1000000069) تم إنشاؤه بواسطة مختبر موفات. [36]

ناقلات Lentiviral تحرير

يتطلب خروج الجين المستهدف باستخدام CRISPR / Cas9 استخدام نظام توصيل لإدخال sgRNA و Cas9 في الخلية. على الرغم من إمكانية توفر عدد من أنظمة التوصيل المختلفة لـ CRISPR ، [37] [38] يتم تنفيذ شاشات فقدان الوظيفة على مستوى الجينوم في الغالب باستخدام نواقل الفيروس البطيئة من الجيل الثالث. [35] [39] [40] هذه النواقل الفيروسية البطيئة قادرة على نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بكفاءة والاندماج بشكل ثابت في جينوم الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة. [41] [42] يتم إنتاج جسيمات الجيل الثالث من الفيروس البطيء عن طريق العدوى المشتركة لخلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293T مع:

  1. اثنان من بلازميدات التعبئة ، أحدهما ترميز Rev والآخر Gag و Pol
  2. مغلف بلازميد قابل للتبديل يشفر لمغلف بروتين سكري لفيروس آخر (الأكثر شيوعًا بروتين G لفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G))
  3. واحد أو اثنان (اعتمادًا على المكتبة المطبقة) يقوم بنقل البلازميدات ، والترميز لـ Cas9 و sgRNA ، بالإضافة إلى علامات التحديد. [35] [43] [44]

يتم حصاد المادة الطافية المحتوية على جسيمات الفيروسة البطيئة وتركيزها واستخدامها لاحقًا لإصابة الخلايا المستهدفة. [45] سيختلف البروتوكول الدقيق لإنتاج الفيروس البطيء اعتمادًا على هدف البحث والمكتبة التطبيقية. [35] [43] [44] إذا تم استخدام نظامين متجهين ، على سبيل المثال ، يتم نقل الخلايا بالتتابع باستخدام Cas9 و sgRNA في إجراء من خطوتين. [35] [44] على الرغم من أن هذا الأمر أكثر تعقيدًا ، إلا أنه يتميز بوجود عيار أعلى لفيروس مكتبة sgRNA. [35]

تحديد النمط الظاهري تحرير

بشكل عام ، هناك تنسيقان مختلفان لشاشات خروج المغلوب CRISPR على مستوى الجينوم: مصفوفة ومجمعة. في شاشة مرتبة ، تحتوي كل بئر على سجرنا محدد ومعروف يستهدف جينًا معينًا. [46] نظرًا لأن sgRNA المسؤول عن كل نمط ظاهري معروف بناءً على موقع البئر ، يمكن تحديد الأنماط الظاهرية وتحليلها دون الحاجة إلى التسلسل الجيني. يسمح هذا التنسيق بقياس أنماط ظاهرية خلوية أكثر تحديدًا ، ربما عن طريق التألق أو التألق ، ويسمح للباحثين باستخدام المزيد من أنواع المكتبات وطرق التسليم. [46] بالنسبة لشاشات LOF واسعة النطاق ، تعتبر التنسيقات المصفوفة منخفضة الكفاءة ومكلفة من حيث الموارد المالية والمادية لأنه يجب عزل مجموعات الخلايا وتربيتها بشكل فردي. [46]

في شاشة مجمعة ، يتم نقل الخلايا المزروعة في وعاء واحد بكميات كبيرة مع نواقل فيروسية تحتوي بشكل جماعي على مكتبة sgRNA بأكملها. للتأكد من أن كمية الخلايا المصابة بأكثر من جسيم واحد يحتوي على sgRNA محدود ، يتم استخدام تعدد منخفض للعدوى (MOI) (عادةً 0.3-0.6). [46] [47] اقترحت الأدلة حتى الآن أنه يجب تمثيل كل sgRNA في 200 خلية على الأقل. [48] ​​[23] سيتم اختيار الخلايا المتحولة ، متبوعًا بالاختيار الإيجابي أو السلبي للنمط الظاهري المطلوب ، وسيكون التسلسل الجيني ضروريًا لتحديد الحمض النووي الريبي المتكامل. [46]

تسلسل الجيل التالي وتحرير تحليل الضربات

بعد اختيار النمط الظاهري ، يتم استخراج الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة المحددة ، جنبًا إلى جنب مع مجموعة خلايا التحكم. [23] [46] [49] في البروتوكولات الأكثر شيوعًا للضربة القاضية على مستوى الجينوم ، يتم إنشاء "مكتبة تسلسل الجيل التالي (NGS)" من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل المكون من خطوتين (PCR). [23] [46] تقوم الخطوة الأولى بتضخيم منطقة sgRNA ، باستخدام بادئات خاصة بتسلسل التكامل الفيروسي البطيء ، والخطوة الثانية تضيف متواليات Illumina i5 و i7. [23] تسمح NGS لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بتحديد sgRNAs المسترجعة ، ويمكن استخدام خطوة القياس الكمي لتحديد الوفرة النسبية لكل sgRNA. [23]

تتمثل الخطوة الأخيرة في الشاشة في التقييم الحسابي لـ sgRNAs المخصب أو المستنفد بشكل كبير ، وتتبعها مرة أخرى إلى الجينات المقابلة لها ، وبالتالي تحديد الجينات والمسارات التي يمكن أن تكون مسؤولة عن النمط الظاهري المرصود. تتوفر حاليًا العديد من الخوارزميات لهذا الغرض ، وأكثرها شيوعًا هو التحليل المستند إلى النموذج لطريقة CRISPR / Cas9 Knockout (MAGeCK) على مستوى الجينوم. [50] تم تطويره خصيصًا لشاشات خروج المغلوب CRISPR / Cas9 في عام 2014 ، أظهر MAGeCK أداءً أفضل مقارنة بالخوارزميات البديلة في ذلك الوقت ، [50] ومنذ ذلك الحين أظهر نتائج قوية وحساسية عالية عبر ظروف تجريبية مختلفة. [51] اعتبارًا من عام 2015 ، تم توسيع خوارزمية MAGeCK لإدخال قياسات مراقبة الجودة ، وحساب كفاءة خروج المغلوب لـ sgRNA التي تم التغاضي عنها سابقًا. [51] تم أيضًا دمج أداة التصور على شبكة الإنترنت (VISPR) ، مما يسمح للمستخدمين باستكشاف النتائج والتحليل وضوابط الجودة بشكل تفاعلي. [51]

آليات الإشارات الخلوية

على مدار السنوات الأخيرة ، ظهرت شاشة CRISPR على مستوى الجينوم كأداة قوية لدراسة الشبكات المعقدة للإشارات الخلوية. [52] الإشارات الخلوية ضرورية لعدد من العمليات البيولوجية الأساسية ، بما في ذلك نمو الخلايا ، وتكاثرها ، وتمايزها ، وموت الخلايا المبرمج.

أحد الأمثلة العملية هو تحديد الجينات المطلوبة للإشارات التكاثرية في الخلايا السرطانية. يتم نقل الخلايا بمكتبة CRISPR sgRNA ، ودراستها للنمو بمرور الوقت. من خلال مقارنة وفرة sgRNA في الخلايا المختارة بعنصر تحكم ، يمكن للمرء تحديد أي sgRNAs أصبحت مستنفدة وبالتالي الجينات التي قد تكون مسؤولة عن عيب الانتشار. تم استخدام هذه الشاشات لتحديد الجينات الأساسية للسرطان في ابيضاض الدم النخاعي الحاد [53] والورم الأرومي العصبي ، [54] ولوصف الاختلافات الخاصة بالورم بين خطوط الخلايا السرطانية. [55]

تحديد الشركاء القاتلين الاصطناعية تحرير

تم تصميم علاجات السرطان الموجهة لاستهداف جينات أو بروتينات أو بيئات معينة تساهم في نمو خلايا الورم أو بقائها على قيد الحياة. ومع ذلك ، بعد فترة من العلاج المطول بهذه العلاجات ، قد تتطور مقاومة الخلايا السرطانية. على الرغم من أن الآليات الكامنة وراء مقاومة أدوية السرطان غير مفهومة جيدًا ، إلا أن الأسباب المحتملة تشمل: التغيير المستهدف ، وتدهور الأدوية ، وهروب موت الخلايا المبرمج ، والتعديلات اللاجينية. [56] المقاومة معروفة جيدًا وتشكل مشكلة خطيرة في إدارة السرطان. [ بحاجة لمصدر ]

للتغلب على هذه المشكلة ، يمكن تحديد شريك قاتل اصطناعي. يمكن استخدام شاشات LOF على مستوى الجينوم باستخدام CRISPR-Cas9 للكشف عن الشركاء القاتلين الاصطناعي. [57] لهذا الغرض ، يتم نقل خط خلية من النوع البري وخط خلية سرطانية يحتوي على الطفرة المسببة للمقاومة باستخدام مكتبة CRISPR sgRNA. يتم زراعة خطي الخلايا ، ويتم تحليل أي خلايا ناقصة التمثيل أو ميتة لتحديد الجينات الشريكة الاصطناعية المميتة المحتملة. دراسة حديثة أجراها هينز وآخرون. (2019) [58] استخدم هذه الطريقة لتحديد التفاعل المميت الصناعي بين عقار العلاج الكيميائي الأسباراجيناز وجينين في مسار إشارات Wnt NKD2 و LGR6.

عوامل تبعية المضيف للعدوى الفيروسية

بسبب الجينوم الصغير والعدد المحدود للبروتينات المشفرة ، تستغل الفيروسات بروتينات المضيف للدخول والتكرار والانتقال. إن تحديد مثل هذه البروتينات المضيفة ، التي يطلق عليها أيضًا عوامل تبعية المضيف (HDFs) ، مهم بشكل خاص لتحديد الأهداف العلاجية. على مدى السنوات الأخيرة ، نجحت العديد من المجموعات في استخدام تقنية CRISPR / Cas9 على مستوى الجينوم كاستراتيجية فحص لـ HDFs في حالات العدوى الفيروسية. [59]

قدم مارسو أحد الأمثلة وآخرون. (2017) ، [60] الذي يهدف إلى تشريح العوامل المضيفة المرتبطة بعدوى حمى الضنك والتهاب الكبد الوبائي سي (اثنان من الفيروسات في الأسرة فلافيفيريدي). تم العثور على ELAVL1 ، وهو بروتين مرتبط بـ RNA تم ترميزه بواسطة جين ELAVL1 ، ليكون مستقبلًا حاسمًا لدخول HCV ، وتم توضيح اختلاف ملحوظ في عوامل اعتماد المضيف بين فلافيفيريدي. [60]

مزيد من التطبيقات تحرير

تشمل التطبيقات الإضافية التي تم الإبلاغ عنها لشاشات كريسبر على مستوى الجينوم دراسة: استقلاب الميتوكوندريا ، [61] مقاومة البكتيريا للسموم ، [62] العوامل الوراثية للورم الخبيث ، [63] مقاومة أدوية السرطان ، [64] موت الخلايا الناجم عن فيروس غرب النيل ، [65] وشبكات جينات الخلايا المناعية. [66] [67]

سيتناول هذا القسم على وجه التحديد شاشات CRISPR على مستوى الجينوم. لمراجعة قيود كريسبر ، انظر Lino et al. (2018) [38]

تحرير مكتبة sgRNA

سيتم تقييد شاشات CRISPR على مستوى الجينوم في النهاية بخصائص مكتبة sgRNA المختارة. ستحتوي كل مكتبة على مجموعة مختلفة من sgRNAs ، وقد يختلف متوسط ​​التغطية لكل جين.تميل المكتبات المتاحة حاليًا إلى أن تكون متحيزة نحو sgRNAs التي تستهدف إكسونات ترميز البروتين المبكرة (5 بوصات) ، بدلاً من تلك التي تستهدف مجالات البروتين الأكثر وظيفية. [58] سلط هينز الضوء على هذه المشكلة وآخرون. (2019) ، [58] الذي أشار إلى أن الجينات المرتبطة بحساسية الأسباراجيناز فشلت في تسجيل نقاط في شاشة الجينوم الواسعة لخلايا سرطان الدم المقاومة للأسباراجيناز.

في حالة عدم توفر مكتبة مناسبة ، فإن إنشاء مكتبة sgRNA جديدة وتضخيمها يعد عملية طويلة قد تستغرق عدة أشهر. تشمل التحديات المحتملة ما يلي: (1) تصميم فعال لـ sgRNA (2) ضمان تغطية شاملة لـ sgRNA في جميع أنحاء الجينوم (3) تصميم العمود الفقري للنواقل الفيروسية (4) إنتاج كميات كافية من الفيروس البطيء عالي الجودة (v) التغلب على كفاءة التحول المنخفضة (6) التحجيم المناسب من الثقافة البكتيرية. [68]

الحفاظ على تغطية sgRNA الخلوية تحرير

تتمثل إحدى أكبر العقبات أمام فحص CRISPR على مستوى الجينوم في ضمان التغطية الكافية لمكتبة sgRNA عبر مجموعة الخلايا. [23] وقد اقترحت الأدلة حتى الآن أنه يجب تمثيل كل sgRNA والحفاظ عليها في 200-300 خلية على الأقل. [23] [48]

مع الأخذ في الاعتبار أن البروتوكول القياسي يستخدم عدوى عدوى

0.3 ، وكفاءة تحويل 30-40٪ [44] [23] يصبح عدد الخلايا المطلوبة لإنتاج والحفاظ على تغطية مناسبة كبيرًا جدًا. على سبيل المثال ، أكثر مكتبات sgRNA البشرية شيوعًا هي مكتبة GeCKO v2 التي أنشأها مختبر Zhang [30] وتحتوي على 123،411 sgRNAs. عادةً ما تنقل الدراسات التي تستخدم هذه المكتبة أكثر من 1 × 10 8 خلايا [58] [59] [69]

مع استمرار CRISPR في إظهار ضوضاء منخفضة وتأثيرات قليلة خارج الهدف ، تتمثل الإستراتيجية البديلة في تقليل عدد sgRNAs لكل جين للشاشة الأولية. يتم استخدام عمليات قطع أقل صرامة لاختيار النتائج ، ويتم استخدام sgRNAs إضافية لاحقًا في شاشة ثانوية أكثر تحديدًا. تم توضيح هذا النهج بواسطة Doench وآخرون. (2016) ، [33] الذي وجد أن & gt92٪ من الجينات التي تم استردادها باستخدام البروتوكول القياسي تم استردادها أيضًا باستخدام عدد أقل من sgRNAs لكل جين. يقترحون أن هذه الاستراتيجية يمكن أن تكون مفيدة في الدراسات التي يكون فيها التوسع باهظ التكلفة. [ بحاجة لمصدر ]

القيود Lentiviral تحرير

نواقل الفيروسة البطيئة لها قيود عامة معينة. أولاً ، من المستحيل التحكم في مكان اندماج الجينوم الفيروسي في جينوم المضيف ، وقد يؤثر ذلك على وظائف مهمة للخلية. فانوتشي وآخرون. [70] يقدم مراجعة ممتازة للنواقل الفيروسية جنبًا إلى جنب مع مزاياها وعيوبها العامة. في السياق المحدد لشاشات CRISPR على مستوى الجينوم ، فإن إنتاج وتحويل جزيئات الفيروسة البطيئة أمر شاق نسبيًا ويستغرق وقتًا طويلاً ، ويستغرق حوالي أسبوعين في المجمل. [44] بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن الحمض النووي يندمج في جينوم المضيف ، فإن توصيل الفيروس البطيء يؤدي إلى تعبير طويل الأمد لـ Cas9 ، مما قد يؤدي إلى تأثيرات خارج الهدف. [ بحاجة لمصدر ]

تحرير الشاشات المصفوفة مقابل المجمعة

في شاشة مرتبة ، تحتوي كل بئر على سجرنا محدد ومعروف يستهدف جينًا معينًا. لذلك ، تسمح الشاشات المصفوفة بالتوصيف التفصيلي لخلية واحدة ، ولكنها محدودة بسبب التكاليف المرتفعة والعمالة المطلوبة لعزل وثقافة العدد الكبير من مجموعات الخلايا الفردية. [46] شاشات CRISPR المجمعة التقليدية بسيطة نسبيًا وفعالة من حيث التكلفة ، ولكنها محدودة بدراسة مجموعة الخلايا بأكملها. هذا يعني أنه قد يكون من الصعب تحديد الطرز المظهرية النادرة ، ويمكن فقط اختيار الأنماط الظاهرية الخام على سبيل المثال. بقاء الخلية أو انتشارها أو التعبير الجيني للمراسل. [ بحاجة لمصدر ]

وسائل الإعلام الثقافية تحرير

قد يؤثر اختيار وسط المزرعة على الأهمية الفسيولوجية للنتائج من تجارب زراعة الخلايا بسبب الاختلافات في تكوين المغذيات وتركيزاتها. [71] تم مؤخرًا عرض تحيز منهجي في مجموعات البيانات الناتجة لشاشات إسكات الجينات CRISPR و RNAi (خاصة للجينات الأيضية) ، [72] وللتوصيف الأيضي لخطوط الخلايا السرطانية. [71] على سبيل المثال ، تم العثور على اعتماد أقوى على ASNS (مركب الأسباراجين) في سلالات الخلايا المزروعة في DMEM ، والتي تفتقر إلى الأسباراجين ، مقارنة بخطوط الخلايا المزروعة في RPMI أو F12 (المحتوية على الأسباراجين). [72] تجنب مثل هذا التحيز يمكن تحقيقه باستخدام وسائط موحدة لجميع خطوط الخلايا التي تم فحصها ، وبشكل مثالي ، باستخدام وسط نمو يمثل المستويات الفسيولوجية للمغذيات بشكل أفضل. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أنواع من الوسائط ، مثل Plasmax [73] و Human Plasma Like Medium (HPLM) ، [74].

كريسبر + تحرير تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية

تهدف التقنيات الناشئة إلى الجمع بين شاشات CRISPR المجمعة والدقة التفصيلية لتسلسل RNA أحادي الخلية المتوازي (RNA-seq). أظهرت الدراسات التي تستخدم "CRISP-seq" ، [75] "CROP-seq" ، [76] و "PERTURB-seq" [77] قراءات جينية غنية ، تحدد بدقة توقيعات التعبير الجيني لعمليات الضربة القاضية للجينات الفردية في مجموعة معقدة من الخلايا . تتمتع هذه الطرق بفائدة إضافية تتمثل في إنتاج ملفات تعريف نسخ للخلايا التي يسببها sgRNA. [ بحاجة لمصدر ]


نتائج

توليد الأليلات الشرطية لـ Mecp2 الجين باستخدام طريقة floxing اثنين من المانحين

لقد حاولنا إعادة إنتاج تجربة تستهدف Mecp2 الجين ، وهو الموضع الذي يكون فيه تكوين الأليلات المفلطحة باستخدام طريقة الفلوكسين من متبرعين فعالًا بنسبة 16٪ [11]. استخدمنا نفس sgRNAs و ssODNs الموصوفة في التقرير الأصلي [11]. أجرت ثلاثة مراكز مستقلة في الجامعة الوطنية الأسترالية (ANU) في أستراليا ، والمركز الطبي بجامعة نبراسكا (UNMC) في الولايات المتحدة الأمريكية ، والمركز التشيكي لعلم الجينات في جمهورية التشيك (IMG) هذه التجارب على الفئران الفطرية C57BL / 6N. تمت زراعة البيضة الملقحة المحقونة بالحقن الميكروي إلى الكيسات الأريمية ، وتم تحليل الحمض النووي الجيني عن طريق التنميط الجيني PCRs وتسلسل Sanger (الجدول 1). باستخدام مزيج تركيز من 10 نانوغرام / ميكرولتر من Cas9 mRNA ، و 10 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNA المنسوخ في المختبر ، و 10 نانوغرام / ميكرولتر من ssODN ، لاحظنا عدم استهداف ناجح (أي الإدراج الصحيح لاثنين LoxP مواقع في رابطة الدول المستقلة-configuration) على الرغم من أن كلا من sgRNAs شق الحمض النووي المستهدف كما يتضح من وجود إينديلز أو تكامل LoxP الموقع في الموقع المطلوب ، والذي يتراوح من 13 إلى 33 ٪ (الجدول 1).

ومن المثير للاهتمام ، أننا لاحظنا الوجود العرضي للطفرات داخل LoxP المواقع التي تشير إلى أحداث إصلاح غير مشروعة في الموقع المستهدف أو أخطاء ناشئة عن DNA المتبرع المركب تجاريًا. تكرار الاستهداف الناجح لشخصين LoxP المواقع في رابطة الدول المستقلة تم الإبلاغ سابقًا عن 16٪ [11] ، وهو ما فشلنا في تكراره.

مسح عالمي لتوليد الأليلات الشرطية باستخدام طريقة floxing ثنائية المانحين

لتقييم كفاءة طريقة floxing المتبرعين في مواقع أخرى بشكل أفضل ، قمنا بتقييم 56 موضعًا إضافيًا في جينوم الفأر من اتحاد مكون من 20 مؤسسة عبر أستراليا وبلجيكا واليابان والولايات المتحدة الأمريكية والمملكة المتحدة وجمهورية التشيك وكندا. (ملف إضافي 1: جدول S1). لم تكن هذه الدراسة مصممة مسبقًا ، بل إنها تشكل بيانات من التجارب التي أجريت في العديد من المختبرات التي حاولت استخدام طريقة floxing ثنائية المانحين لإنشاء نماذج cKO الماوس. تجدر الإشارة إلى أنه نظرًا لأن الظروف التجريبية الموصوفة في الطريقة الأصلية لم تنتج كفاءات مرغوبة ، فقد قامت المختبرات في اتحادنا بتعديل الظروف التجريبية في محاولة لزيادة كفاءتها. لقد أبلغنا عن تجميع مثل هذه البيانات من هذه المختبرات ، وبالتالي ، فإنها تمثل بشكل طبيعي "وضعًا في العالم الحقيقي" لأنها تشكل العديد من الخصائص المتنوعة التي لم يتم التخطيط لها مسبقًا. لذلك ، قدمت مجموعة البيانات هذه فرصة للتحقيق في تأثير العديد من المعلمات المختلفة على كفاءة الطريقة.

تم جمع بيانات floxing المتبرعين من الاتحاد من خلال دراسة استقصائية حيث طُلب من المحققين إدخال تفاصيل عن المعلمات المختلفة للتجارب في ملف Excel Spreadaheet. لسهولة عرض مجموعة البيانات الكبيرة ، قمنا بتقسيم المعلومات من جدول بيانات واحد إلى 3 جداول بيانات أصغر. يتم تقديم هذه البيانات والنتائج كملف إضافي 1: الجدول S1 ، والملف الإضافي 2: الجدول S2 ، والملف الإضافي 3: الجدول S3 ، ويتم تقديم الملخص العام للنتائج في ملف إضافي 4: الجدول S4. من أصل 17،887 زيجوت (17،557 حقنة دقيقة و 330 ملقحة ، انظر التفاصيل أدناه) ، تم نقل 12،764 (71.4 ٪) جراحيًا إلى إناث متلقية. أنجبت الإناث المتلقية 1718 جروًا (9.6٪ من الزيجوتات الملقحة المحقونة / الكهربية) ، منها 15 جروًا فقط (0.87٪) تحتوي على الأليلات المفلطحة.

تحليل العوامل التي تؤثر على نتيجة طريقة floxing اثنين من المانحين

مكنتنا مجموعة البيانات الكبيرة هذه من تحليل العوامل المختلفة التي تؤثر على نتيجة طريقة floxing ثنائية المانحين. تضمنت هذه العوامل سلالات مختلفة من الفئران ، وطبيعة الموقع (الجينات الأساسية مقابل الجينات غير الأساسية) ، والمسافة بين دليلين ، وطريقة مختلفة للتسليم (الحقن المجهري أو التثقيب الكهربائي) ، وتنسيقات مختلفة من الكاشف ، وتركيزات مختلفة من الكاشف ، والاختلافات في ممارسات اختبار الدليل ( تقوم بعض المعامل باختبار الدليل RNAs ، والبعض الآخر لا يقوم بذلك). تم تنفيذ غالبية المشاريع على خلفية C57BL / 6J (39) بينما استخدمت 18 مشروعًا خلفية C57BL / 6N و 3 مشاريع إضافية استخدمت خلفية ماوس هجينة (B6C3HF1 ، B6SJLF1 ، FVBCD1F1). التحليل الإحصائي لبياناتنا (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.74) لم يجد أي تأثير لخلفية الإجهاد على كفاءة الطريقة. من بين 56 موقعًا مستهدفًا (49 حقنة دقيقة و 7 محقنة بالكهرباء) ، تم تصنيف 21 موقعًا كجينات أساسية بناءً على معدل الوفيات المبكرة للجنين أو بعد الولادة للفئران المتماثلة اللواقح بالضربة القاضية وفقًا لقاعدة بيانات جينوم الفأر http://www.informatics.jax.org [12] . تم الإبلاغ عن عمليات حذف مستهدفة مسبقًا لـ 18 من أصل 56 موقعًا لتوليد فئران متماثلة اللواقح كانت قابلة للحياة في مرحلة البلوغ ، وكانت عواقب طفرة فارغة في 17 موقعًا غير معروفة. معًا ، يشير هذا إلى أن إعادة التقسيم بين الجين المستهدف الأساسي وغير الأساسي المفترض كان على قدم المساواة (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.76). باستخدام طريقة التعلم الآلي المنشورة سابقًا للتنبؤ بأهمية الجينات في الفئران [13] ، أكدنا تواترًا متساويًا للجينات الأساسية وغير الأساسية في مجموعة البيانات الخاصة بنا (اختبار فيشر الدقيق ، ص = 0.99) اختلفت المسافة بين sgRNA من 250 نقطة أساس إلى 1.1 ميجا بايت بمتوسط ​​2 كيلو بايت. exons مفردة للجينات بأكملها أو مناطق الجينوم التنظيمي (ملف إضافي 1: الجدول S1) تم حشوها. لقد حققنا فيما إذا كانت المسافة بين sgRNA أمرًا بالغ الأهمية لاحتمالية نجاح طريقة floxing ثنائية المانحين. فشلنا في العثور على مثل هذا الدليل في مجموعة البيانات الخاصة بنا (اختبار رتبة Kruskal-Wallis ، مربع خي = 32 ، ص = 0.42) ، على الرغم من أن حجم العينة كان منخفضًا جدًا لتكوين نتيجة (حجم تأثير كوهين د = 0.40 بقوة 1-بيتا = 0.27). من بين 56 موقعًا ، تم حقن 49 موقعًا دقيقًا (ملف إضافي 2: الجدول S2) وتم إمداد 7 مواضع بالكهرباء (ملف إضافي 3: الجداول S3). من بين البيئات الملقحة الدقيقة لـ 49 موقعًا مع 53 تصميمًا مستقلًا ، تم حقن أعداد أكبر بكثير من البيضة الملقحة في نواة النواة وحدها (26/53) بدلاً من السيتوبلازم وحده (10/53) أو كلاهما من النواة والسيتوبلازم (17/53) (فيشر) الاختبار الدقيق ص = 0.004) ، وهو ما يتوافق مع الممارسة الحالية في معظم المرافق الأساسية المحورة جينيا (الشكل 2 أ). تم استخدام أشكال مختلفة من كواشف CRISPR (سجرنا اصطناعي أو في المختبر مكتوب ، أو بروتين Cas9 مرنا أو بروتين Cas9 ، أو بلازميد معرب عن sgRNA- و Cas9) (ملف إضافي 1: الجدول S1). غالبية المشاريع المستخدمة في المختبر نسخ mRNA (35/59) بتركيزات مختلفة تتراوح من 10 إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر من Cas9 مرنا (الشكل 2 ب) ومن 10 إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر سجرنا. تم تسليم ssODN بتركيز يتراوح من 10 إلى 200 نانوغرام / ميكرولتر. في 18 حالة ، تم تسليم Cas9 كبروتين بتركيز يتراوح من 10 إلى 75 نانوغرام / ميكرولتر. تم اختبار سبعة وستين بالمائة (41 زوجًا من 61 زوجًا) من sgRNAs في اختبار الانقسام في المختبر قبل الحقن الملقح. لم نجد أي اختلافات في كفاءات التحرير بين مجموعتي sgRNA المختبرة وغير المختبرة [5 أدلة ′: اختبار Kruskal-Wallis لمجموع الرتبة ، مربع كاي = 0.004 ، ص = 0.94 3 ′ أدلة: اختبار رتبة مجموع Kruskal-Wallis ، مربع كاي = 0.2 ، ص = 0.65]. ومن المثير للاهتمام ، أنه بالنسبة لـ 6 مواضع ، تم تسليم Cas9 و sgRNAs في شكل بلازميد خيمري sgRNA-SpCas9 (pX330) بتركيز 5 نانوغرام / ميكرولتر. سعينا إلى تحديد ما إذا كانت أشكال توصيل الكاشف مثل البلازميد ، أو البروتين النووي الريبي (RNP) ، أو الرنا المرسال سيكون لها تأثير على الكفاءة الكلية في الاستهداف باستخدام طريقة floxing ثنائية المتبرعين. فشلنا في العثور على مثل هذا الدليل (اختبار فيشر الدقيق ص = 1).

التقييم الكمي لنجاح طريقة floxing اثنين من المانحين. أ طريقة حقن اللاقحة (النوى ، السيتوبلازم ، أو كليهما) لتوصيل كواشف كريسبر المستخدمة من قبل مراكز الإبلاغ. تشير الأرقام إلى النسبة المئوية لإجمالي اللقاحات المحقونة أو الملقحة بالكهرباء. ب شكل كواشف كريسبر (مرنا ، بروتين ، أو بلازميد) يتم توصيله إلى البيضة الملقحة. تشير الأرقام إلى النسب المئوية. ج عدد الأليلات التي تم تحريرها بنجاح وصحيحة LoxP عمليات الإدخال من إجمالي عدد الجراء الحية من الزيجوت المحقونة الدقيقة والمنقولة. تشير الأرقام إلى أرقام مطلقة. د أنواع التحرير التي تمت ملاحظتها بين الجراء الأحياء الذين تم تنميطهم وراثيًا من عينة فرعية من 25 موقعًا. تشير الأرقام إلى القيم المطلقة

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير Electroporation للحيوانات الملقحة كطريقة فعالة لتوليد الضربة القاضية أو الطفرات النقطية أو الأليلات الموسومة أو الشرطية [14،15،16،17،18،19،20]. من اتحادنا ، قامت ثلاثة مختبرات وبرامج بمسح احتمالية نجاح الطريقة. بالنسبة لسبعة مواقع تم مسحها ، لاحظنا النجاح في إدخال واحد LoxP أليل (ملف إضافي 3: الجدول S3) من تحليل الكيسة الأريمية أو الفئران الحية لاثنين من أصل سبعة مواضع. في المقابل ، لاحظنا تكرارًا مرتفعًا نسبيًا لعمليات الحذف الكبيرة و إينديلز (تصل إلى 39٪ من عمليات الحذف الكبيرة) تشير إلى نجاح التحرير. ومع ذلك ، لم يظهر أي من المواقع اثنين LoxP المواقع المدرجة في رابطة الدول المستقلة في النسل ، مما يشير إلى أن توصيل كواشف كريسبر عن طريق التثقيب الكهربائي لا يحدث فرقًا إحصائيًا في الحصول على النتيجة المرجوة من نهج الفلوكس ثنائي المانحين ، على الرغم من أن الأعداد الكبيرة من الأجنة التي يمكن التلاعب بها تسمح باستعادة كمية صغيرة جدًا عدد الأليلات المستهدفة بشكل صحيح.

بعد ذلك ، افترضنا أن النجاح في توليد أليلات floxed باستخدام نهج floxing ثنائي المانحين قد يعتمد على عوامل مثل (1) كفاءة sgRNA ، (2) التزامن في LoxP الإدراج ، أو (3) تركيز الكواشف Cas9 و sgRNA و ssODN. لاكتساب نظرة ثاقبة على هذه الاحتمالات ، قمنا بتحليل البيانات من 56 موقعًا (ملف إضافي 2: الجدول S2 ، ملف إضافي 3: الجدول S3). لاحظ أنه تم تحليل النسل لـ 54 موقعًا في مرحلة ما بعد الولادة (ملف إضافي 2: الجدول S2 ، ملف إضافي 3: الجدول S3) بينما تم تحليل موقعين في مرحلة الكيسة الأريمية (ملف إضافي 3: الجدول S3). في بعض الحالات ، تم تحليل المواقع بشكل أكبر لتقييم نشاط الانقسام التوجيهي. من بين 1684 فأر مؤسس ، نفذ 676 (40٪) أحداث التحرير. أظهر مائتان وثلاثة وسبعون فأرًا (16٪) نوعًا من التحرير (إينديلز و / أو البدائل) ، و 225 (13٪) و 180 (11٪) فأرًا كان يؤوي واحدًا LoxP الإدراج أو الحذف بين موقعي الانقسام ، على التوالي (الشكل 2 ج). تم تقييم الفئران لـ 25/56 موقعًا إضافيًا لأحداث التحرير الإضافية بما في ذلك عمليات الحذف الكبيرة (الشكل 2 ج). من 487 فأر مؤسس تم تحليلها (من تلك 25 موقعًا) ، 219 (45٪) 203 (41٪) ، 52 (10.7٪)٪ ، و (13) 2.7٪ عينة لا تحتوي على تحرير ، إينديلز، غير مرتبطة LoxP الإدخالات ، أو الحذف الكبير ، على التوالي (الشكل 2 د). من بين 1684 حيوانًا تم تحليلها ، تم استهداف 15 فأرًا فقط (0.87٪) بشكل صحيح دون أن يمسها أحد LoxP مواقع في رابطة الدول المستقلة-التكوين (ملف إضافي 2: الجدول S2). من بين 56 موقعًا ، تم استهداف 11 موقعًا فقط بنجاح (19.6٪). كان متوسط ​​عدد الحيوانات الملقحة اللازمة لتوليد حيوان واحد مستهدف بشكل صحيح هو 1192. لم يكن لأهمية الجينات أي تأثير على احتمالية نجاح عملية الفلوكس من مانحين اثنين (4/23 نجاح في استهداف الموت الجنيني أو بعد الولادة مقابل 5/18 بالنسبة للفئران متماثلة اللواقح القابلة للحياة و 2/15 للوفاة الجنينية أو بعد الولادة غير المعروفة ، اختبار فيشر الدقيق ص = 0.27). لاحظنا أيضًا من بياناتنا ، من بين 56 موقعًا تم تحليلها ، أظهر 14 ٪ عمليات حذف بين الموقعين المستهدفين لانقسام Cas9. لاحظنا أيضًا حدوثًا مرتفعًا نسبيًا للعزباء LoxP عمليات الإدخال لـ & gt 20٪ من الفئران ذات التنميط الجيني (من جميع المواقع) وعدد قليل من حالات عبر-LoxP عمليات الإدراج (على أليلات مختلفة ، مما يقلل من احتمال الإدراج الصحيح لـ LoxP المواقع) (الشكل 3). لذلك افترضنا أن نجاح هذا النهج يعتمد على الكفاءة المشتركة لـ sgRNA واحتمال حدوث ذلك LoxP الإدراج في كلا الموقعين لتمكين اثنين في رابطة الدول المستقلة تحدث أحداث HDR في وقت واحد. لتقييم هذا الافتراض ، أجرينا تحليل الانحدار الخطي المعمم لنمذجة العلاقة بين Cas9 وتركيز sgRNA وكفاءة انقسام sgRNA والمسافة بين LoxP الإدخالات وتكرار LoxP عمليات الإدراج ، مع نجاح طريقة الفلوكسين ثنائية المانحين كنتيجة إيجابية. تم تلخيص التحليلات في الجدول 2. كفاءة LoxP يبدو أن عمليات الإدراج في كل من مواقع 5 و 3 هي أفضل مؤشر لاحتمال نجاح طريقة floxing ذات المتبرعين ، حيث تمثل أكثر من 80 ٪ من التباين الكلي. ومع ذلك ، لم يكن هذا المتنبئ مهمًا في نموذج الانحدار الخطي الخاص بنا. تنبئ إضافية مثل كفاءة أو كفاءة sgRNA في 5 ′ أو 3 إدراج LoxP أوضح ما يقرب من 15٪ من التباين الإجمالي ، لكن لم يكن أي من هذه المتنبئات مهمًا في نموذجنا. يمثل تركيز Cas9 mRNA أقل من 0.1٪ من التباين الكلي ولكنه كان ذا دلالة إحصائية (ص & lt 0.01) في نموذج الانحدار الخطي المعمم كمؤشر لنجاح طريقة floxing ثنائية المانحين. ومع ذلك ، فإن نجاح طريقة floxing من اثنين من المانحين كان مرتبطًا بشكل هامشي بزيادة تركيز Cas9 mRNA (ص 2 بيرسون = 0.27 ، ص = 0.08). من تحليلنا حجم عينة الناجح LoxP الإدخالات في رابطة الدول المستقلة كانت أصغر من أن تستبعد بشكل قاطع أي مؤشرات أخرى (حجم تأثير كوهين د = 0.4 ، الطاقة 1-بيتا = 0.41). استنتجنا أن تحليل المكان فقط حيث LoxP وقد لوحظ أن أحداث الإدراج قد تتنبأ بشكل أفضل باحتمالية نجاح هذا النهج (على الرغم من أن تلك الإدخالات لم تكن موجودة رابطة الدول المستقلةالتكوينات). لاختبار ذلك ، أجرينا تحليلًا إحصائيًا فقط على تلك المواقع التي تحتوي على LoxP المواقع واستبعاد المواقع الناقصة LoxP عمليات الإدراج في أي من مواقع انشقاق الدليل.حددنا 28 موقعًا من هذا القبيل (من إجمالي 56 موقعًا). لم نجد أي فرق في التنبؤ بنتيجة التحليل السابق بكل المواقع (البيانات غير معروضة). تشير هذه النتائج معًا إلى أن وجود حدثين متزامنين لإعادة التركيب بدا أنه أفضل مؤشر لتوليد أليلين مفلوكسين في رابطة الدول المستقلة على الرغم من أن تركيز Cas9 mRNA المرتفع بدا أنه مؤشر آخر ، إلا أن تأثيره كان هامشيًا.

النتائج المرغوبة وغير المرغوبة لطريقة الفلوكسينغ ثنائية المانحين. أ-و يُظهر موضع من النوع البري exons 3 و 4 و 5 من الجين الافتراضي حيث يتم اختيار exon 4 كإكسون مستهدف للإدخال LoxP المواقع. أ النتيجة المرجوة تظهر الأليل floxed. كان الحدوث الإجمالي & lt 1٪. بF نتائج غير مرغوب فيها مختلفة بما في ذلك واحدة فقط LoxP إدراج الموقع (ب)، فقط إينديلز تم إنشاؤه في أحد المواقع أو كلاهما (ج)، مزيج من LoxP الإدراج و إينديلز (د) ، الحذف بين موقعي الانقسام (ه)، و لا إينديل أو لا أحداث الإدراج (F)

لتحديد ما إذا كانت العوامل مثل تكوين النوكليوتيدات في ssODN المانح أو طول ssODN أو تركيز الكاشف قد تفسر نجاح هذا النهج ، قمنا بتطبيق خوارزمية التعلم الآلي (الغابات العشوائية) على جميع المواقع التي تم استهدافها بشكل صحيح أو غير صحيح [21 ]. عبر التحقق من صحة نموذج التعلم الآلي عن طريق تجميع التمهيد (المعروف أيضًا باسم "خطأ خارج الحقيبة") ، لم نجد أي ارتباط بين نجاح هذا النهج وتركيز الكواشف (ص القيمة = 0.84) ، طول الجهة المانحة 5 ′ و 3 ssODN (على التوالي ص قيم 0.21 و 0.18) أو تركيبات النوكليوتيدات في الموقع المستهدف. بشكل عام ، لاحظنا أداءً منخفضًا للنموذج عند تضمين طول مانح ssODN ، وتركيب النوكليوتيدات في الموقع المستهدف ، وتركيز الكواشف مع "قيمة تقدير خارج الكيس" عند 0.222. باختصار ، فإن تقييم الانحدار جنبًا إلى جنب مع تحليل التعلم الآلي لا يمكن أن يحدد بوضوح أي عوامل محددة تساهم في عدم كفاءة طريقة floxing ثنائية المانحين.

تأثير عامل مهارة الحقن المجهري على نتيجة طريقة الفلوكسين المتبرعين

نظرًا لأن الحقن المجهري هو أحد أهم الخطوات في تجارب تحرير جينوم الماوس ، فقد افترضنا أن كفاءة هذه الطريقة قد تعتمد على مهارات الموظفين التقنيين الذين يقومون بإجراء الحقن المجهري. إذا أثرت المهارة على النتيجة (على سبيل المثال ، أليلات الفلوكس الناجحة) ، فسنكون قادرين على تحديد الفرق بين المختبرات. قمنا بتقييم هذه المعلمة من خلال حساب الارتباط بين المختبر كقيمة تنبؤية والنتيجة الإيجابية (الأليلات المفلطحة الناجحة). لم نعثر على أي دليل على تأثير "المهارة" الذي يؤثر على النتيجة الإيجابية (اختبار مرتبة Kruskal-Wallis ، مربع كاي = 22 ، ص = 0.16).

كتحليل مستقل لتأثير مهارة الحقن المجهري ، قمنا بتجميع نوع آخر من مجموعات البيانات الكبيرة (إنشاء نماذج طرق باستخدام مانح واحد ssODN) من اتحادنا الذي قام بقياس مهارات الحقن المجهري للموظفين التقنيين في اتحادنا. 20 مختبرًا شاركت في هذه الدراسة (بما في ذلك مختبر ANU الذي اختبر فقط Mecp2 locus) حققت نسبة نجاح تقارب 90٪ في إنشاء نماذج ضرب متبرع واحدة لـ ssODN 293 من أصل 330 موقعًا تمت تجربتها بكفاءة إجمالية قدرها 13٪ من الفئران الحية التي تحمل أليلات الضربة المرغوبة (ملف إضافي 5: الجدول S5) ، مما يشير إلى أن جميع المختبرات التي شاركت في الدراسة لديها مهارات حقن مكروي كافية لإنشاء نماذج باستخدام أداة كريسبر. لذلك ، لم يكن عدم النجاح في توليد الأليلات المفلورة باستخدام طريقة floxing ثنائية المانحين في المعامل العشرين المشاركة بسبب نقص المهارات التقنية في الحقن الملقح الدقيق لكواشف CRISPR.

تقييم كفاءات الطرق الأخرى لتوليد الأليلات الشرطية

في السنوات الأخيرة ، تم وصف بعض الطرق الأخرى لتوليد الأليلات الشرطية باستخدام الحمض النووي من متبرع واحد ، مثل سهولة-CRISPR (الإضافات الفعالة مع إدراجات ssDNA-CRISPR) أو CLICK (CRISPR مع أليلات lssDNA التي تحفز cKO) أو الطرق المستندة إلى DNA مزدوج الشريطة (dsDNA) [17 ، 22 ، 23]. افترضنا أن أحد أسباب انخفاض كفاءة طريقة floxing ثنائية المتبرعين يمكن أن يكون أنها تتطلب حدثين لإعادة التركيب (كل منهما يخضع بشكل مستقل لأحداث طفرية) في حين أن حدث إعادة تركيب واحد فقط يكفي لـ "DNA متبرع واحد " أساليب. لاختبار هذه الفرضية ، استخدمنا طريقة الحمض النووي من متبرع واحد لتوليد أليل شرطي في عدة مواقع والتي فشلت في البداية باستخدام طريقة floxing ثنائية المتبرعين. من بين 61 مشروع استهداف مستقل (لـ 56 موقعًا) ، فشل 48 مشروعًا بطريقة المانحين. تم بعد ذلك تكرار تسعة من هذه المشاريع باستخدام نهج مانح الحمض النووي أحادي الجديلة الطويلة (4 مع سهل-طريقة CRISPR ، 5 مع طريقة CLICK) ، مشروعان باستخدام طريقة مانح dsDNA ، ومشروع واحد باستهداف خلايا ES التقليدية. بشكل ملحوظ ، أدت جميع طرق المتبرع الواحد إلى توليد ناجح للأليلات المتضخمة (ملف إضافي 6: الجدول S6). من بين 11 مشروعًا تستخدم أساليب Easi-CRISPR أو CLICK أو dsDNA ، وجدنا أن متوسط ​​معدل النجاح كان 18.3٪ ± 13٪ بمتوسط ​​13.2٪ ، وهو ما يتوافق مع متوسط ​​تحسن بمقدار 20 ضعفًا عن طريقة floxing ثنائية المانحين. (اختبار Kolmogorov-Smirnov ص القيمة & لتر 10 −5). لقد درسنا ما إذا كان متوسط ​​معدل النجاح هذا 18.3 ٪ يمكن أن يكون بسبب ارتفاع كفاءة الانقسام في sgRNAs. تحليلنا لكفاءات الانقسام دليل 5 و 3 (عن طريق عد indel أو LoxP أحداث الإدراج) تشير إلى أن الأمر ليس كذلك (Mann-Whitney يو اختبار مع كل منها ص القيمة 0.43 و 1 تشير إلى أن الاختلاف في كفاءة التحرير ليس سبب هذا التناقض في معدل النجاح بين هاتين الطريقتين).

التفسير المحتمل للاختلاف الكبير في الكفاءة بين طريقة floxing ذات المتبرعين وتلك التي تستخدم الحمض النووي من متبرع واحد هو أن هذا الأخير يتطلب حدثًا واحدًا فقط لإعادة التركيب بينما تعتمد طريقة floxing ثنائية المانحين على حدثين لإعادة التركيب يحدثان في رابطة الدول المستقلة. إذا كانت هذه الفرضية صحيحة ، فيجب أن نلاحظ اختلافًا في تكرار الإدخال المتزامن في مواقع 3 و 5 بين هاتين الطريقتين. للتأكد من هذه الفرضية ، قمنا بمقارنة تكرار عمليات الإدراج المتزامنة لـ LoxP مواقع في 3 و 5 لتسليم Easi-CRISPR أو CLICK أو dsDNA وطريقة floxing من متبرعين اثنين ، ووجدت بالفعل فرقًا (6 ± 20 ٪ floxing من متبرعين مقابل 76 ± 27 ٪ للطرق الأخرى Mann-Whitney يو اختبار دبليو = 1, ص القيمة = 4.7 × 10 5) لتأكيد فرضيتنا.

تم الإبلاغ مؤخرًا عن تعديلين لطريقة floxing ثنائية المانحين. يتضمن التعديل الأول إدخال الثاني LoxP الموقع عن طريق حقنة ثانية من الكواشف في الملقحات المشتقة من خطوط الماوس للحقن الأول الذي يحتوي على واحد فقط من الاثنين LoxP عمليات الإدراج [24]. نشير إلى هذه الطريقة باسم "الثانية LoxP الإدراج في الجيل القادم ". التعديل الثاني يتضمن إدخال LoxP المواقع على فترتين منفصلتين في نفس الزيجوت ، الأول في مرحلة الخلية الواحدة والثاني في المرحلة المكونة من خليتين [25]. نشير إلى هذه الطريقة باسم "التسليم المتسلسل LoxP المواقع. " اختبرنا 7 (من أصل 48 مشروعًا فاشلاً) باستخدام "الثانية LoxP الإدراج في الجيل التالي "(ملف إضافي 6: الجدول S6) ، وكل ذلك أدى إلى التوليد الناجح للأليلات المتضخمة. وجدنا 14 ± 6٪ و 27 ± 32٪ كفاءات في الأول والثاني على التوالي LoxP تجارب الإدخال ، والتي تشير إلى أن وتيرة إعادة التركيب أعلى بكثير عند إدخال واحد فقط LoxP يتم التعامل معها كحدث منفصل. وبعبارة أخرى ، فإن كفاءة أحداث الإدخال "من متبرع واحد" (الأحداث الفردية) أعلى بكثير من الكفاءة المجمعة لإدخال مانحين اثنين. على الرغم من أن هذا النهج يستغرق ما يقرب من عام واحد لإكماله ، إلا أن الطريقة تولد في نهاية المطاف أليلات floxed بكفاءة مكافئة لـ "نهج مانح واحد" مثل Easi-CRISPR أو CLICK أو تسليم dsDNA. اختبرنا أيضًا "نهج التسليم المتسلسل" ، وهو التعديل الثاني لطريقة floxing ثنائية المانحين التي تم تقديمها أعلاه ، على ثلاثة مواضع جديدة ، ولكن لم ينتج أي منها أليلات شرطية (ملف إضافي 7: الجدول S7). نلاحظ أننا اختبرنا فقط وضع الحقن المجهري للتسليم لتقييم نهج التسليم المتسلسل. بالنظر إلى أن Electroporation يعتبر نهجًا أقل قسوة (لأنه يحافظ على قدر معقول بما فيه الكفاية من صلاحية البيضة الملقحة بعد جولتين متتاليتين من إدخال الكاشف) ، نقترح أن هذه الطريقة قد تتطلب مزيدًا من التقييم في مواقع إضافية لاستخلاص استنتاج حول كفاءتها.


شكر وتقدير

نشكر O. Shalem، D.A. سكوت و P.D. Hsu لإجراء مناقشات مفيدة ورؤى ثاقبة لـ R. Belliveau لدعم البحث الشامل R. Macrae للقراءة النقدية للمخطوطة ومختبر Zhang بأكمله للحصول على الدعم والمشورة. O.O.A. حصل على الدعم من زمالة بول وديزي سوروس ، وزمالة أصدقاء معهد ماكغفرن ، ومركز بويتراس للاضطرابات العاطفية. ج. كان مدعومًا من قبل زمالة الخريجين في العلوم الحاسوبية من وزارة الطاقة. ف. تم دعمه من قبل المعاهد الوطنية للصحة من خلال المعهد الوطني للصحة العقلية (NIMH منح 5DP1-MH100706 و 1R01-MH110049) ، ومؤسسة العلوم الوطنية (NSF) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) ، ومؤسسة نيويورك للخلايا الجذعية ، وسيمونز Foundation ، ومؤسسة Paul G. Allen Family ، ومؤسسة Vallee ، وجيمس وباتريشيا بويتراس ، وروبرت ميتكالف ، وديفيد تشينج. ف. هو محقق روبرتسون في مؤسسة نيويورك للخلايا الجذعية. الكواشف متاحة من خلال منتديات دعم Addgene وتتوفر الأدوات الحسابية عبر موقع Zhang للمختبر (http://www.genome-engineering.org).


محتويات

تحرير التسلسلات المتكررة

حدث اكتشاف تكرار الحمض النووي العنقودي بشكل مستقل في ثلاثة أجزاء من العالم. أول وصف لما سيُطلق عليه لاحقًا CRISPR هو من الباحث بجامعة أوساكا يوشيزومي إيشينو وزملاؤه في عام 1987. لقد استنسخوا عن طريق الخطأ جزءًا من تسلسل CRISPR مع "IAP " (تحويل isozyme من الفوسفاتيز القلوي) من جينوم الإشريكية القولونية [14] [15] كان هذا هو هدفهم. كان تنظيم التكرارات غير عادي. عادة ما يتم ترتيب التسلسلات المتكررة بشكل متتالي ، دون تشتيت تسلسلات مختلفة. [15] [11] لم يعرفوا وظيفة التكرارات العنقودية المتقطعة.

في عام 1993 ، باحثون من السل الفطري في هولندا ، مقالتين حول مجموعة من التكرارات المباشرة المتقطعة (DR) في تلك البكتيريا. لقد أدركوا تنوع التسلسلات التي تدخلت في التكرارات المباشرة بين سلالات مختلفة من مرض السل [16] واستخدمت هذه الخاصية لتصميم طريقة كتابة تم تسميتها التنميط، والذي لا يزال قيد الاستخدام حتى اليوم. [17] [18]

درس فرانسيسكو موخيكا من جامعة أليكانتي بإسبانيا التكرارات التي لوحظت في الكائنات الحية القديمة هالوفيراكس و هالواركولا الأنواع ووظائفها. اعتقد مشرف Mojica في ذلك الوقت أن التكرارات العنقودية لها دور في الفصل الصحيح للحمض النووي المكرر في الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية لأن البلازميدات والكروموسومات ذات المصفوفات المتكررة المتماثلة لا يمكن أن تتعايش في هالوفيراكس فولكاني. ولوحظ أيضًا نسخ التكرارات المتقطعة لأول مرة ، وكان هذا أول توصيف كامل لـ CRISPR. [18] [19] بحلول عام 2000 ، أجرى موخيكا مسحًا للأدب العلمي وأجرى أحد طلابه بحثًا في الجينوم المنشور باستخدام برنامج ابتكره بنفسه. حددوا التكرارات المتقطعة في 20 نوعًا من الميكروبات على أنها تنتمي إلى نفس العائلة. [20] في عام 2001 ، اقترح Mojica و Ruud Jansen ، اللذان كانا يبحثان عن تكرارات متقطعة إضافية ، الاختصار CRISPR (التكرارات المتقطعة القصيرة المتباعدة بشكل منتظم) لتخفيف الارتباك الناجم عن الاختصارات العديدة المستخدمة لوصف التسلسلات في الأدبيات العلمية. [19] [21] في عام 2002 ، تانغ وآخرون. أظهر دليلًا على أن كريسبر يكرر مناطق من جينوم Archaeoglobus fulgidus تم نسخها إلى جزيئات RNA طويلة تمت معالجتها لاحقًا إلى وحدات RNA صغيرة بطول الوحدة ، بالإضافة إلى بعض الأشكال الأطول من 2 أو 3 أو أكثر من وحدات تكرار المباعدة. [22] [23]

في عام 2005 ، اكتشف الباحث الزبادي رودولف بارانجو ذلك العقدية الحرارية، بعد تحديات الملتهمة التكرارية ، تطور مقاومة الملتهمة المتزايدة ، وترجع هذه المقاومة المعززة إلى دمج تسلسلات فواصل كريسبر الإضافية. [24] ثم طورت شركة دانيسكو للأغذية الدنماركية ، والتي كان يعمل بها بارانجو في ذلك الوقت ، مقاومة لاقمات البكتيريا S. ثيرموفيلوس سلالات لاستخدامها في إنتاج الزبادي. تم شراء Danisco لاحقًا بواسطة DuPont ، التي "تمتلك حوالي 50 في المائة من سوق ثقافة منتجات الألبان العالمية" وأصبحت التكنولوجيا سائدة. [25]

تعديل الأنظمة المرتبطة بـ CRISPR

جاءت إضافة رئيسية لفهم كريسبر مع ملاحظة يانسن أن مجموعة تكرار بدائيات النوى كانت مصحوبة بمجموعة من الجينات المتماثلة التي تشكل الأنظمة المرتبطة بـ CRISPR أو كاس الجينات. أربعة كاس الجينات (كاس 1-4) في البداية. أظهرت بروتينات Cas زخارف هيلياز ونوكلياز ، مما يشير إلى دور في الهيكل الديناميكي لمواقع كريسبر. [26] في هذا المنشور ، تم استخدام الاختصار كريسبر كاسم عالمي لهذا النمط. ومع ذلك ، ظلت وظيفة كريسبر غامضة.

في عام 2005 ، أظهرت ثلاث مجموعات بحثية مستقلة أن بعض فواصل كريسبر مشتقة من دنا الملتهمة والحمض النووي خارج الصبغيات مثل البلازميدات. [30] [31] [32] في الواقع ، الفواصل عبارة عن شظايا من الحمض النووي التي تم جمعها من الفيروسات التي حاولت في السابق مهاجمة الخلية. كان مصدر الفواصل علامة على أن كريسبر /كاس يمكن أن يكون للنظام دور في المناعة التكيفية في البكتيريا. [27] [33] تم رفض جميع الدراسات الثلاث التي اقترحت هذه الفكرة في البداية من قبل المجلات رفيعة المستوى ، لكنها ظهرت في النهاية في مجلات أخرى. [34]

المنشور الأول [31] الذي يقترح دور CRISPR-Cas في المناعة الميكروبية ، من قبل Mojica والمتعاونين في جامعة Alicante ، تنبأ بدور لنسخة RNA للفواصل في التعرف على الهدف في آلية يمكن أن تكون مماثلة لتدخل RNA نظام تستخدمه الخلايا حقيقية النواة. وسع كونين وزملاؤه فرضية تداخل الحمض النووي الريبي هذه من خلال اقتراح آليات عمل لأنواع فرعية مختلفة من كريسبر-كاس وفقًا للوظيفة المتوقعة لبروتيناتهم. [35]

كشف العمل التجريبي الذي قامت به عدة مجموعات عن الآليات الأساسية لمناعة CRISPR-Cas. في عام 2007 ، نُشر أول دليل تجريبي على أن كريسبر جهاز مناعي تكيفي. [11] [4] منطقة كريسبر في العقدية الحرارية الفواصل المكتسبة من الحمض النووي لجراثيم مسبب للعدوى. تلاعب الباحثون بمقاومة S. ثيرموفيلوس لأنواع مختلفة من الملتهمة عن طريق إضافة وحذف الفواصل التي يتطابق تسلسلها مع تلك الموجودة في العاثيات المختبرة. [36] [37] في عام 2008 ، حدد Brouns و Van der Oost مركبًا من بروتينات Cas (يُسمى Cascade) في بكتريا قولونية قطع سلائف CRISPR RNA داخل التكرارات إلى جزيئات RNA ناضجة تحتوي على مباعد تسمى CRISPR RNA (crRNA) ، والتي ظلت مرتبطة بمركب البروتين. [38] علاوة على ذلك ، فقد وجد أن Cascade و crRNA و Helicase / nuclease (Cas3) كانت مطلوبة لتزويد مضيف بكتيري بمناعة ضد العدوى بفيروس DNA. من خلال تصميم CRISPR المضاد للفيروسات ، أظهروا أن اتجاهين من crRNA (الإحساس / مضاد الدلالة) يوفران مناعة ، مما يشير إلى أن أدلة crRNA كانت تستهدف dsDNA. في ذلك العام أكد كل من Marraffini و Sontheimer أن تسلسل CRISPR لـ S. البشرة تستهدف الحمض النووي وليس RNA لمنع الاقتران. كان هذا الاكتشاف مخالفًا للآلية المقترحة للتدخل الشبيه بالـ RNA لمناعة CRISPR-Cas ، على الرغم من وجود نظام CRISPR-Cas الذي يستهدف RNA الأجنبي في وقت لاحق. Pyrococcus furiosus. [11] [36] أظهرت دراسة أجريت عام 2010 أن كريسبر-كاس يقطع كلا من خيطي العاثية والبلازميد في S. ثيرموفيلوس. [39]

تحرير Cas9

درس الباحثون نظام CRISPR أبسط من الأبراج العقدية الذي يعتمد على بروتين Cas9. نوكلياز Cas9 عبارة عن نظام مكون من أربعة مكونات يشتمل على جزيئين صغيرين: crRNA و CRISPR RNA المنشط عبر (tracrRNA). [40] [41] أعادت جينيفر دودنا وإيمانويل شاربنتير هندسة نوكلياز Cas9 إلى نظام مكون من مكونين أكثر قابلية للإدارة من خلال دمج جزيئي الحمض النووي الريبي في "الحمض النووي الريبي أحادي الدليل" والذي ، عند دمجه مع Cas9 ، يمكن أن يجد ويقطع هدف الحمض النووي المحدد بواسطة دليل RNA. كانت هذه المساهمة مهمة للغاية لدرجة أنها اعترفت بها جائزة نوبل في الكيمياء في عام 2020. من خلال التلاعب في تسلسل النيوكليوتيدات لتوجيه الحمض النووي الريبي ، يمكن برمجة نظام Cas9 الاصطناعي لاستهداف أي تسلسل DNA للانقسام. [42] مجموعة أخرى من المتعاونين تضم فيرجينيوس تشيكشنيز مع جاسيناس وبارانجو وهورفاث أظهرت أن Cas9 من S. ثيرموفيلوس يمكن أيضًا إعادة برمجة نظام CRISPR لاستهداف موقع من اختيارهم عن طريق تغيير تسلسل crRNA الخاص به. غذت هذه التطورات الجهود لتحرير الجينوم باستخدام نظام CRISPR-Cas9 المعدل. [18]

نشرت المجموعات بقيادة Feng Zhang و George Church أوصافًا لتحرير الجينوم في مزارع الخلايا البشرية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 للمرة الأولى. [11] [43] [44] ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، بما في ذلك خميرة الخباز (خميرة الخميرة) ، [45] [46] [47] الممرض الانتهازي المبيضات البيض، [48] [49] الزرد (دانيو ريريو) ، [50] ذباب الفاكهة (ذبابة الفاكهة سوداء البطن) ، [51] [52] النمل (مملح Harpegnathos [53] و Ooceraea biroi [54]) ، البعوض (الزاعجة المصرية [55]) ، الديدان الخيطية (أنواع معينة انيقة) ، [56] النباتات ، [57] الفئران ، [58] [59] القرود [60] والأجنة البشرية. [61]

تم تعديل كريسبر لعمل عوامل نسخ قابلة للبرمجة تسمح للعلماء باستهداف جينات معينة وتنشيطها أو إسكاتها. [62]

أظهر نظام CRISPR-Cas9 إمكانية إجراء تعديلات جينية فعالة في الزيجوتات ثلاثية النواة البشرية التي تم وصفها لأول مرة في ورقة عام 2015 من قبل العالمين الصينيين P. Liang و Y. Xu. نجح النظام في إجراء انقسام ناجح لطفرة بيتا هيموغلوبين (HBB) في 28 من أصل 54 جنينًا. تم بنجاح إعادة تجميع 4 من 28 جنينًا باستخدام نموذج مانح قدمه العلماء. أظهر العلماء أنه أثناء إعادة تركيب الحمض النووي للخيط المشقوق ، يتنافس التسلسل الداخلي المتماثل HBD مع قالب المتبرع الخارجي. إن إصلاح الحمض النووي في الأجنة البشرية أكثر تعقيدًا وخصوصية من الخلايا الجذعية المشتقة. [63]

Cas12a (Cpf1 سابقًا) تحرير

في عام 2015 ، تم تمييز نوكلياز Cas12a (المعروف سابقًا باسم Cpf1 [64]) في نظام CRISPR / Cpf1 للبكتيريا فرانسيسيلا نوفيسيدا. [65] [66] اسمها الأصلي ، من تعريف عائلة بروتين TIGRFAMs الذي تم بناؤه في عام 2012 ، يعكس انتشار النوع الفرعي CRISPR-Cas في بريفوتيلا و فرانسيسيلا الأنساب. أظهر Cas12a العديد من الاختلافات الرئيسية عن Cas9 بما في ذلك: التسبب في قطع "متداخلة" في الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بدلاً من القطع "الحاد" الذي ينتجه Cas9 ، بالاعتماد على PAM "T rich" (توفير مواقع استهداف بديلة لـ Cas9) ويتطلب فقط CRISPR RNA (crRNA) لاستهداف ناجح. على النقيض من ذلك ، يتطلب Cas9 كلاً من crRNA و crRNA للمعاملات (tracrRNA).

قد تمنح هذه الاختلافات Cas12a بعض المزايا مقارنة بـ Cas9. على سبيل المثال ، تعد crRNAs الصغيرة لـ Cas12a مثالية لتحرير الجينوم متعدد الإرسال ، حيث يمكن حزم عدد أكبر منها في ناقل واحد مقارنة بـ sgRNAs الخاصة بـ Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجزاء اللزجة 5 ′ التي خلفها Cas12a لتجميع الحمض النووي الذي يكون أكثر تحديدًا للهدف من استنساخ إنزيم التقييد التقليدي. [67] أخيرًا ، يشق Cas12a أزواجًا قاعدية 18-23 من الحمض النووي في اتجاه مجرى النهر من موقع PAM. هذا يعني أنه لا يوجد اضطراب في تسلسل التعرف بعد الإصلاح ، وبالتالي يتيح Cas12a جولات متعددة من انقسام الحمض النووي. على النقيض من ذلك ، نظرًا لأن Cas9 يقطع 3 أزواج أساسية فقط في الجزء العلوي من موقع PAM ، فإن مسار NHEJ ينتج عنه طفرات indel التي تدمر تسلسل التعرف ، وبالتالي منع المزيد من جولات القطع. من الناحية النظرية ، يجب أن تتسبب الجولات المتكررة لانقسام الحمض النووي في زيادة فرصة حدوث التحرير الجيني المطلوب. [68] من السمات المميزة لـ Cas12a ، مقارنةً بـ Cas9 ، أنه بعد قطع هدفه ، يظل Cas12a مرتبطًا بالهدف ثم يشق جزيئات ssDNA الأخرى دون تمييز. [69] تسمى هذه الخاصية نشاط "الانقسام الجانبي" أو نشاط "الانقسام العابر" وقد تم استغلالها لتطوير تقنيات التشخيص المختلفة. [70] [71]

Cas13 (C2c2 سابقًا) تحرير

في عام 2016 ، كان نوكلياز Cas13a (المعروف سابقًا باسم C2c2) من البكتيريا ليبتوتريشيا شاهي تميزت. Cas13 هو نوكلياز داخلي من الحمض النووي الريبي RNA الموجه ، مما يعني أنه لا يشق الحمض النووي ، ولكن فقط الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة. يتم توجيه Cas13 من خلال crRNA الخاص به إلى هدف ssRNA ويربط الهدف ويشقّه. على غرار Cas12a ، يظل Cas13 مرتبطًا بالهدف ثم يشق جزيئات ssRNA الأخرى دون تمييز. [72] تم استغلال خاصية الانقسام الجانبي هذه لتطوير تقنيات التشخيص المختلفة. [73] [74] [75]

يكرر والفواصل تحرير

تتكون مصفوفة كريسبر من تسلسل قائد غني بالآلية متبوعًا بتكرارات قصيرة مفصولة بفواصل فريدة. [76] عادةً ما يتراوح حجم تكرار CRISPR من 28 إلى 37 زوجًا أساسيًا (bps) ، على الرغم من أنه يمكن أن يكون هناك أقل من 23 زوجًا أساسًا وما يصل إلى 55 زوجًا أساسًا. [77] يُظهر البعض تناظر ثنائي ، مما يعني تكوين بنية ثانوية مثل حلقة جذعية ("دبوس الشعر") في الحمض النووي الريبي ، بينما تم تصميم البعض الآخر ليكون غير منظم. يتراوح حجم الفواصل في مصفوفات CRISPR المختلفة عادةً من 32 إلى 38 نقطة أساس (النطاق من 21 إلى 72 نقطة أساس). [77] يمكن أن تظهر الفواصل الجديدة بسرعة كجزء من الاستجابة المناعية لعدوى العاثيات. [78] عادة ما يكون هناك أقل من 50 وحدة من تسلسل المباعد المتكرر في مصفوفة كريسبر. [77]

تحرير هياكل CRISPR RNA

تعديل جينات Cas والأنواع الفرعية لـ CRISPR

مجموعات صغيرة من كاس غالبًا ما توجد الجينات بجوار مصفوفات المباعد المتكررة CRISPR. مجتمعة 93 كاس يتم تجميع الجينات في 35 عائلة بناءً على تشابه تسلسل البروتينات المشفرة. 11 من 35 عائلة تشكل كاس الأساسية ، والتي تشمل عائلات البروتين Cas1 من خلال Cas9. يحتوي موضع CRISPR-Cas الكامل على جين واحد على الأقل ينتمي إلى كاس جوهر. [79]

تنقسم أنظمة CRISPR-Cas إلى فئتين. تستخدم أنظمة الفئة 1 مركبًا من عدة بروتينات كاس لتقليل الأحماض النووية الأجنبية. تستخدم أنظمة الفئة 2 بروتين Cas كبير واحد لنفس الغرض. تنقسم الفئة 1 إلى أنواع I و III و IV وتنقسم الفئة 2 إلى أنواع II و V و VI. [80] تنقسم أنواع الأنظمة الستة إلى 19 نوعًا فرعيًا. [81] يتميز كل نوع ومعظم الأنواع الفرعية بـ "جين التوقيع" الموجود بشكل حصري تقريبًا في هذه الفئة. يعتمد التصنيف أيضًا على تكملة كاس الجينات الموجودة. تحتوي معظم أنظمة CRISPR-Cas على بروتين Cas1. تتوافق سلالة بروتينات Cas1 بشكل عام مع نظام التصنيف. [79] تحتوي العديد من الكائنات الحية على العديد من أنظمة CRISPR-Cas مما يشير إلى أنها متوافقة وقد تشترك في المكونات. [82] [83] يشير التوزيع المتقطع للأنواع الفرعية لـ CRISPR / Cas إلى أن نظام CRISPR / Cas يخضع لنقل الجينات الأفقي أثناء التطور الميكروبي.

مناعة CRISPR-Cas هي عملية طبيعية للبكتيريا والعتائق. [98] يمنع كريسبر-كاس عدوى العاثيات ، الاقتران والتحول الطبيعي عن طريق تحطيم الأحماض النووية الأجنبية التي تدخل الخلية. [36]

تحرير الحصول على فاصل

عندما يتم غزو ميكروب من قبل العاثية ، فإن المرحلة الأولى من الاستجابة المناعية هي التقاط الحمض النووي للعاثية وإدخاله في موضع كريسبر على شكل فاصل. تم العثور على Cas1 و Cas2 في كلا النوعين من أنظمة المناعة CRISPR-Cas ، مما يشير إلى أنهما متورطان في اكتساب المباعد. أكدت دراسات الطفرات هذه الفرضية ، حيث أظهرت أن إزالة كاس 1 أو كاس 2 أوقف اكتساب المباعد ، دون التأثير على استجابة كريسبر المناعية. [99] [100] [101] [102] [103]

تم توصيف العديد من بروتينات Cas1 وحل بنياتها. [104] [105] [106] تحتوي بروتينات Cas1 على متواليات مختلفة من الأحماض الأمينية. ومع ذلك ، فإن هياكلها البلورية متشابهة وجميع بروتينات Cas1 المنقاة عبارة عن نوكليازات / عبارات متكاملة تعتمد على المعادن وترتبط بالحمض النووي بطريقة مستقلة عن التسلسل. [82] تم توصيف بروتينات Cas2 التمثيلية وتمتلك إما (خيط مفرد) ssRNA- [107] أو (حبلا مزدوج) dsDNA- [108] [109] نشاط نووي نوكلياز داخلي محدد.

في نظام I-E بكتريا قولونية يشكل Cas1 و Cas2 معقدًا حيث يقوم Cas2 dimer بجسر اثنين من ثنائيات Cas1. [110] في هذا المركب ، يؤدي Cas2 دور سقالة غير إنزيمي ، [110] ربط شظايا مزدوجة الجديلة من الحمض النووي الغازي ، بينما يربط Cas1 الأجنحة المفردة من الحمض النووي ويحفز اندماجها في مصفوفات CRISPR. [111] [112] [113] عادة ما يتم إضافة فواصل جديدة في بداية كريسبر بجانب التسلسل الرئيسي لإنشاء سجل كرونولوجي للعدوى الفيروسية. [114] في بكتريا قولونية إن بروتين شبيه بالهيستون يسمى عامل مضيف التكامل (IHF) ، والذي يرتبط بالتسلسل الرئيسي ، هو المسؤول عن دقة هذا التكامل. [115] يعزز IHF أيضًا كفاءة التكامل في نظام I-F من بكتوبكتيريوم atrosepticum. [116] ولكن في أنظمة أخرى قد تكون هناك حاجة إلى عوامل مضيفة مختلفة [117]

تحرير الزخارف المجاورة Protospacer

كشف تحليل المعلومات الحيوية لمناطق جينومات الملتهمة التي تم استئصالها كفواصل (تسمى الفواصل الأولية) أنه لم يتم اختيارها عشوائياً ولكن بدلاً من ذلك تم العثور عليها بالقرب من تسلسل الحمض النووي القصير (3-5 بي بي) الذي يطلق عليه الزخارف المجاورة الأولية (PAM). أظهر تحليل أنظمة CRISPR-Cas أن PAMs مهمة للنوع الأول والنوع الثاني ، ولكن ليس لأنظمة النوع الثالث أثناء الاستحواذ. [32] [118] [119] [120] [121] [122] في أنظمة النوع الأول والنوع الثاني ، يتم استئصال الفواصل الأولية في المواضع المجاورة لتسلسل PAM ، مع قطع الطرف الآخر من المباعد باستخدام آلية المسطرة ، وبالتالي الحفاظ على انتظام حجم المباعد في مصفوفة كريسبر. [123] [124] يختلف الحفاظ على تسلسل PAM بين أنظمة CRISPR-Cas ويبدو أنه مرتبط تطوريًا بـ Cas1 وتسلسل القائد. [122] [125]

تتم إضافة فواصل جديدة إلى مصفوفة كريسبر بطريقة اتجاهية ، [30] تحدث بشكل تفضيلي ، [78] [118] [119] [126] [127] ولكن ليس حصريًا ، بجوار [121] [124] تسلسل القائد. تحليل نوع نظام I-E من بكتريا قولونية أظهر أن التكرار المباشر الأول المجاور للتسلسل الرئيسي ، تم نسخه ، مع إدخال الفاصل المكتسب حديثًا بين التكرارات المباشرة الأولى والثانية. [102] [123]

يبدو أن تسلسل PAM مهم أثناء إدخال المباعد في أنظمة النوع I-E. يحتوي هذا التسلسل على نيوكليوتيد نهائي محفوظ بقوة (nt) بجوار أول nt من protospacer. يصبح هذا nt القاعدة النهائية في أول تكرار مباشر. [103] [128] [129] يشير هذا إلى أن آلية الحصول على المباعد تولد بروزات مفردة الجديلة في الموضع الثاني إلى الأخير للتكرار المباشر وفي PAM أثناء إدخال المباعد. ومع ذلك ، لا يبدو أن جميع أنظمة CRISPR-Cas تشترك في هذه الآلية لأن PAMs في الكائنات الحية الأخرى لا تظهر نفس مستوى الحفظ في الموضع النهائي. [125] من المحتمل أنه في تلك الأنظمة ، يتم إنشاء نهاية حادة في نهاية التكرار المباشر والفاقم الأولي أثناء الاستحواذ.

متغيرات الإدراج تحرير

تحليل Sulfolobus solfataricus كشفت CRISPRs عن مزيد من التعقيدات للنموذج الكنسي لإدخال المباعد ، حيث قام أحد مواضع CRISPR الستة بإدخال فواصل جديدة بشكل عشوائي عبر مصفوفة CRISPR ، بدلاً من إدخال أقرب تسلسل للقائد. [124]

تحتوي كريسبر المتعددة على العديد من الفواصل لنفس العاثية. تم اكتشاف الآلية التي تسبب هذه الظاهرة في نظام النوع I-E بكتريا قولونية. تم الكشف عن تحسين كبير في الحصول على المباعد حيث تستهدف الفواصل بالفعل الملتهمة ، وحتى عدم التطابق مع الفاصل الأولي. يتطلب هذا "التمهيدي" أن تتفاعل بروتينات Cas المشاركة في كل من الاكتساب والتداخل مع بعضها البعض. توجد الفواصل المكتسبة حديثًا والتي تنتج عن آلية التحضير دائمًا على نفس الشريط مثل مباعد التمهيدي. [103] [128] [129] أدت هذه الملاحظة إلى فرضية أن آلية الاكتساب تنزلق على طول الحمض النووي الغريب بعد التحضير للعثور على بروتوسفاسر جديد. [129]

تحرير التكوين الحيوي

يجب إنشاء CRISPR-RNA (crRNA) ، الذي يوجه لاحقًا نوكلياز Cas إلى الهدف أثناء خطوة التداخل ، من تسلسل CRISPR. يتم نسخ crRNA في البداية كجزء من نسخة طويلة واحدة تشمل الكثير من مصفوفة CRISPR. [28] يتم بعد ذلك شق هذه النسخة بواسطة بروتينات كاس لتشكيل crRNAs. تختلف آلية إنتاج crRNAs بين أنظمة CRISPR / Cas. في أنظمة النوع I-E والنوع I-F ، يتعرف البروتينان Cas6e و Cas6f على التوالي ، على حلقات جذعية [130] [131] [132] تم إنشاؤها عن طريق اقتران التكرارات المتطابقة التي تحيط بالكرنا. [133] تشق بروتينات Cas هذه النسخة الأطول عند حافة المنطقة المقترنة ، تاركة كرنا منفردًا مع بقايا صغيرة من منطقة التكرار المزدوجة.

تستخدم أنظمة النوع الثالث أيضًا Cas6 ، ولكن تكرارها لا ينتج حلقات جذعية. يحدث الانقسام بدلاً من ذلك عن طريق التفاف النص الأطول حول Cas6 للسماح بالانقسام فقط في بداية تسلسل التكرار. [134] [135] [136]

تفتقر أنظمة النوع الثاني إلى الجين Cas6 وبدلاً من ذلك تستخدم RNaseIII للانقسام. تقوم أنظمة النوع الثاني الوظيفية بتشفير الحمض النووي الريبي (RNA) الصغير الإضافي المكمل لتسلسل التكرار ، والمعروف باسم كرنا عبر التنشيط (tracrRNA). [40] يؤدي نسخ tracrRNA ونسخة كريسبر الأولية إلى الاقتران الأساسي وتكوين الرنا المزدوج الجديلة في تسلسل التكرار ، والذي يتم استهدافه لاحقًا بواسطة RNaseIII لإنتاج crRNAs. على عكس النظامين الآخرين ، لا يحتوي crRNA على فاصل كامل ، والذي يتم قطعه في أحد طرفيه. [91]

ترتبط CrRNAs ببروتينات Cas لتشكيل مجمعات ريبونوكليوتيد تتعرف على الأحماض النووية الأجنبية. لا تُظهر CrRNAs أي تفضيل بين السلاسل المشفرة وغير المشفرة ، مما يدل على نظام استهداف الحمض النووي الريبي الموجه. [5] [39] [99] [103] [137] [138] [139] يتطلب معقد النوع I-E (يشار إليه عادة باسم Cascade) خمسة بروتينات Cas مرتبطة بـ crRNA واحد. [140] [141]

تحرير التدخل

أثناء مرحلة التداخل في أنظمة النوع الأول ، يتم التعرف على تسلسل PAM على الشريط التكميلي crRNA وهو مطلوب جنبًا إلى جنب مع التلدين crRNA. في أنظمة النوع الأول ، يشير الاقتران الأساسي الصحيح بين crRNA و protospacer إلى تغيير توافقي في Cascade الذي يجند Cas3 لتدهور الحمض النووي.

تعتمد أنظمة النوع الثاني على بروتين واحد متعدد الوظائف ، Cas9 ، لخطوة التداخل. [91] يتطلب Cas9 كلاً من crRNA و tracrRNA لتعمل وتشق الحمض النووي باستخدام نطاقات نوكلياز داخلية شبيهة بـ HNH و RuvC / RNaseH. مطلوب تقوية الأساس بين PAM وجينوم الملتهمة في أنظمة النوع الثاني. ومع ذلك ، يتم التعرف على PAM على نفس الخيط مثل crRNA (الخيط المعاكس لأنظمة النوع الأول).

تتطلب أنظمة النوع الثالث ، مثل النوع الأول ، ستة أو سبعة بروتينات Cas مرتبطة بـ crRNAs. [142] [143] تم تحليل أنظمة النوع الثالث من S. solfataricus و P. furiosus كلاهما يستهدف الرنا المرسال للعاقمات بدلًا من جينوم دنا العاثيات ، [83] [143] مما قد يجعل هذه الأنظمة قادرة بشكل فريد على استهداف جينومات العاثيات القائمة على الحمض النووي الريبي. [82] تم العثور أيضًا على أنظمة من النوع الثالث تستهدف الحمض النووي بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي باستخدام بروتين Cas مختلف في المركب ، Cas10. [144] تبين أن انقسام الحمض النووي يعتمد على النسخ. [145]

آلية تمييز الذات عن الحمض النووي الغريب أثناء التداخل مبنية في crRNAs ومن ثم فمن المحتمل أن تكون مشتركة بين جميع الأنظمة الثلاثة. خلال عملية النضج المميزة لكل نوع رئيسي ، تحتوي جميع crRNAs على تسلسل مباعد وجزء من التكرار في أحد الطرفين أو كلاهما. إنه تسلسل التكرار الجزئي الذي يمنع نظام CRISPR-Cas من استهداف الكروموسوم كاقتران أساسي يتجاوز إشارات تسلسل المباعد الذاتية ويمنع انقسام الحمض النووي. [146] تم تصنيف إنزيمات CRISPR الموجهة بالـ RNA على أنها إنزيمات تقييد من النوع الخامس.

يُعتقد أن جينات cas في المهايئ ووحدات المستجيب لنظام CRISPR-Cas قد تطورت من وحدتين مختلفتين عن الأسلاف. تم إدخال عنصر شبيه باللينقول يسمى casposon يشفر التكامل الشبيه بـ Cas1 والمكونات الأخرى المحتملة لوحدة التكيف بجانب وحدة المستجيب السلفي ، والتي من المحتمل أن تعمل كنظام مناعي فطري مستقل. [147] تطورت جينات cas1 و cas2 المحفوظة بشكل كبير لوحدة المحول من الوحدة السلفية بينما تطورت مجموعة متنوعة من جينات C المستجيب من الفئة 1 من وحدة المستجيب السلفي. تم توجيه تطور هذه الجينات المختلفة لوحدات المستجيب من الفئة 1 بآليات مختلفة ، مثل أحداث الازدواجية. [149] من ناحية أخرى ، نشأ كل نوع من وحدات المستجيب من الفئة 2 من عمليات إدخال مستقلة لاحقة لعناصر وراثية متحركة. [150] حلت هذه العناصر الوراثية المتنقلة محل وحدات المستجيب الجيني المتعددة لإنشاء وحدات المستجيب الجيني الفردي التي تنتج بروتينات كبيرة تؤدي جميع المهام الضرورية لوحدة المستجيب. [150] يتم أخذ مناطق المباعدة لأنظمة CRISPR-Cas مباشرة من العناصر الوراثية المتنقلة الأجنبية وبالتالي يصعب تتبع تطورها على المدى الطويل. [151] وُجد أن التطور غير العشوائي لمناطق المباعدة هذه يعتمد بشكل كبير على البيئة والعناصر الوراثية الأجنبية المتنقلة الخاصة التي تحتوي عليها. [152]

يمكن لـ CRISPR / Cas تحصين البكتيريا ضد بعض العاثيات وبالتالي إيقاف انتقال العدوى. لهذا السبب ، وصف كونين كريسبر / كاس كآلية لاماركية للميراث. [153] ومع ذلك ، فقد اعترض أحد النقاد على هذا الأمر حيث قال: "يجب أن نتذكر [لامارك] لما قدمه من خير في العلم ، وليس للأشياء التي تشبه نظريته بشكل سطحي فقط. في الواقع ، التفكير في كريسبر والظواهر الأخرى على أنها لاماركية فقط يحجب الطريقة البسيطة والأنيقة التي يعمل بها التطور حقًا ". [154] ولكن مع إجراء المزيد من الدراسات الحديثة ، أصبح من الواضح أن مناطق المباعدة المكتسبة لأنظمة CRISPR-Cas هي بالفعل شكل من أشكال تطور لامارك لأنها طفرات جينية يتم اكتسابها ثم نقلها. [155] من ناحية أخرى ، فإن تطور آلية جين كاس التي تسهل النظام يتطور من خلال التطور الدارويني الكلاسيكي. [155]

تحرير Coevolution

كشف تحليل تسلسل كريسبر عن التطور المشترك للجينوم المضيف والفيروسي. [156] بروتينات Cas9 غنية بالبكتيريا المسببة للأمراض والبكتيريا المتعايشة. قد يساهم تنظيم الجينات بوساطة كريسبر / كاس في تنظيم الجينات البكتيرية الذاتية ، خاصة أثناء التفاعل مع مضيفات حقيقية النواة. على سبيل المثال، فرانسيسيلا نوفيسيدا يستخدم فريدًا وصغيرًا من الحمض النووي الريبي المرتبط بـ CRISPR / Cas (scaRNA) لقمع نسخة داخلية ترميز البروتين الدهني البكتيري الضروري لـ F. نوفيسيدا لتثبيط استجابة المضيف وتعزيز الفوعة. [157]

النموذج الأساسي لتطور كريسبر هو فواصل مدمجة حديثًا تدفع العاثيات إلى تحور جينوماتها لتجنب الاستجابة المناعية البكتيرية ، مما يخلق التنوع في كل من العاثيات والمجموعات المضيفة. لمقاومة عدوى الملتهمة ، يجب أن يتوافق تسلسل فاصل CRISPR تمامًا مع تسلسل جين فج الهدف. يمكن أن تستمر العاثيات في إصابة مضيفيها عند حدوث طفرات نقطية في المباعد. [146] مطلوب صرامة مماثلة في PAM أو تظل السلالة البكتيرية حساسة للعاثية. [119] [146]

تعديل الأسعار

دراسة 124 S. ثيرموفيلوس أظهرت السلالات أن 26٪ من جميع الفواصل كانت فريدة وأن مواضع CRISPR المختلفة أظهرت معدلات مختلفة لاكتساب المباعد. [118] تتطور بعض مواقع كريسبر بسرعة أكبر من غيرها ، مما سمح بتحديد علاقات تطور السلالات. أظهر تحليل الجينوم المقارن ذلك بكتريا قولونية و S. المعوية تتطور بشكل أبطأ بكثير من S. ثيرموفيلوس. سلالات الأخيرة التي تباعدت قبل 250 ألف سنة لا تزال تحتوي على نفس المكمل الفاصل. [158]

أظهر التحليل الميتاجينومي لاثنين من الأغشية الحيوية لتصريف الألغام الحمضية أن أحد كريسبر الذي تم تحليله يحتوي على عمليات حذف واسعة وإضافات مباعدة مقابل الأغشية الحيوية الأخرى ، مما يشير إلى نشاط / انتشار عاثيات أعلى في مجتمع واحد عن الآخر. [78] في تجويف الفم ، حددت دراسة زمنية أن 7-22٪ من المباعدات تمت مشاركتها على مدى 17 شهرًا مع الفرد بينما أقل من 2٪ تمت مشاركتها بين الأفراد. [127]

من نفس البيئة تم تتبع سلالة واحدة باستخدام بادئات PCR الخاصة بنظام CRISPR الخاص بها. أظهرت النتائج واسعة النطاق لوجود / غياب المباعد تنوعًا كبيرًا. ومع ذلك ، أضافت كريسبر 3 فواصل على مدار 17 شهرًا ، [127] مما يشير إلى أنه حتى في بيئة ذات تنوع كريسبر كبير ، فإن بعض المواقع تتطور ببطء.

تم تحليل كريسبر من الميتاجينومات المنتجة لمشروع الميكروبيوم البشري. [159] على الرغم من أن معظمها كانت خاصة بموقع الجسم ، إلا أن بعضها داخل موقع الجسم يتم مشاركته على نطاق واسع بين الأفراد. نشأ أحد هذه المواقع من أنواع العقديات واحتوت على ≈15000 مباعد ، 50 ٪ منها كانت فريدة من نوعها. على غرار الدراسات المستهدفة لتجويف الفم ، أظهر البعض تطورًا طفيفًا بمرور الوقت. [159]

تمت دراسة تطور كريسبر في الكيموستات باستخدام S. ثيرموفيلوس لفحص معدلات اقتناء المباعد مباشرة. في أسبوع واحد، S. ثيرموفيلوس اكتسبت السلالات ما يصل إلى ثلاثة فواصل عند الطعن بعاثة واحدة. [160] خلال نفس الفترة الزمنية ، طورت العاثية تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة التي أصبحت ثابتة في المجتمع ، مما يشير إلى أن الاستهداف منع تكاثر العاثيات في غياب هذه الطفرات. [160]

اخر س.ثيرموفيلوس أظهرت التجربة أن العاثيات يمكن أن تصيب وتتكاثر في العوائل التي لديها فاصل استهداف واحد فقط. أظهر آخر أن العوائل الحساسة يمكن أن توجد في بيئات ذات عيارات عالية من العاثيات. [161] تشير الدراسات القائمة على النظام الكيميائي والمراقبة إلى العديد من الفروق الدقيقة لتطور كريسبر والعاثية (المشترك).

تتوزع كريسبر على نطاق واسع بين البكتيريا والعتائق [87] وتظهر بعض أوجه التشابه في التسلسل. [133] وأبرز ما يميزها هو تكرار الفواصل وتكرارها المباشر. هذه الخاصية تجعل من السهل التعرف على كريسبر في تسلسلات طويلة من الحمض النووي ، لأن عدد التكرارات يقلل من احتمالية التطابق الإيجابي الخاطئ. [162]

يعد تحليل CRISPRs في البيانات metagenomic أكثر صعوبة ، حيث لا يتم تجميع مواقع CRISPR عادةً ، بسبب طبيعتها المتكررة أو من خلال تباين الإجهاد ، مما يخلط بين خوارزميات التجميع. في حالة توفر العديد من الجينومات المرجعية ، يمكن استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم مصفوفات CRISPR وتحليل محتوى المباعد. [118] [127] [163] [164] [165] [166] ومع ذلك ، فإن هذا النهج ينتج معلومات فقط عن CRISPRs المستهدفة على وجه التحديد والكائنات الحية ذات التمثيل الكافي في قواعد البيانات العامة لتصميم بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يمكن استخدام البادئات المنحلة الخاصة بالتكرار لتضخيم فواصل كريسبر مباشرة من العينات البيئية ، ويمكن بعد ذلك تجميع الأمبليكونات التي تحتوي على فواصل أو ثلاثة فواصل حسابية لإعادة بناء مصفوفات كريسبر الطويلة. [166]

البديل هو استخراج وإعادة بناء مصفوفات كريسبر من بيانات ميتاجينوميات البندقية. يعد هذا أكثر صعوبة من الناحية الحسابية ، خاصة مع تقنيات تسلسل الجيل الثاني (مثل 454 ، Illumina) ، حيث تمنع أطوال القراءة القصيرة ظهور أكثر من وحدتين أو ثلاث وحدات متكررة في قراءة واحدة. تم تحقيق تحديد CRISPR في القراءات الأولية باستخدام بحت من جديد تحديد [167] أو باستخدام متواليات التكرار المباشر في مصفوفات CRISPR المجمعة جزئيًا من contigs (مقاطع DNA المتداخلة التي تمثل معًا منطقة إجماع من DNA) [159] وتسلسلات التكرار المباشر من الجينومات المنشورة [168] كخطاف لتحديد التكرارات المباشرة في القراءات الفردية.

هناك طريقة أخرى للبكتيريا للدفاع ضد عدوى العاثيات وهي امتلاك جزر صبغية. نوع فرعي من جزر الكروموسومات يسمى جزيرة الكروموسومات المحرضة بالعاثية (PICI) يتم استئصاله من كروموسوم بكتيري عند الإصابة بالعاثية ويمكن أن يمنع تكاثر العاثيات. [169] يتم تحريض PICIs ، واستئصالها ، وتكرارها ، ثم تعبئتها أخيرًا في كبسولات صغيرة بواسطة عاثيات معتدلة من المكورات العنقودية. تستخدم PICIs عدة آليات لمنع تكاثر الملتهمة. في الآلية الأولى ، يقوم Ppi المشفر بواسطة PICI بشكل تفاضلي بحظر نضج الملتهمة عن طريق الارتباط أو التفاعل على وجه التحديد مع Phage TerS ، وبالتالي يحجب تكوين معقد TerS / TerL المسؤول عن تعبئة الحمض النووي للعاثية. في الآلية الثانية ، تقوم PICI CpmAB بإعادة توجيه البروتين المورفوجيني لقفيصة الملتهمة لجعل 95٪ من الحمض النووي للقفيصة والعاثية بحجم SaPI يمكن أن يحزم فقط ثلث جينومهما في هذه القفيصة الصغيرة ومن ثم تصبح فجّة غير قابلة للحياة. [170] تتضمن الآلية الثالثة بروتينين ، PtiA و PtiB ، يستهدفان بروتين LtrC المسؤول عن إنتاج بروتينات الفيريون والتحلل. يتم تعديل آلية التداخل هذه بواسطة بروتين تعديل ، PtiM ، يرتبط بأحد البروتينات الوسيطة للتداخل ، PtiA ، وبالتالي تحقيق المستوى المطلوب من التداخل. [171]

أظهرت إحدى الدراسات أن الملتهمة ICP1 lytic ، والتي تستهدف على وجه التحديد ضمة الكوليرا حصلت مجموعة serogroup O1 على نظام CRISPR / Cas الذي يستهدف a ضمة الكوليرا عنصر يشبه PICI. يحتوي النظام على 2 CRISPR loci و 9 جينات Cas. يبدو أنه متماثل مع نظام IF الموجود في يرسينيا بيستيس. علاوة على ذلك ، مثل نظام CRISPR / Cas البكتيري ، يمكن لـ ICP1 CRISPR / Cas الحصول على تسلسلات جديدة ، مما يسمح للعاثية والمضيف بالتطور المشترك. [172]

ثبت أن بعض الفيروسات البدائية تحمل مصفوفات CRISPR المصغرة التي تحتوي على فاصل واحد أو اثنين. لقد ثبت أن الفواصل الموجودة داخل مصفوفات CRISPR المحمولة بالفيروسات تستهدف فيروسات وبلازميدات أخرى ، مما يشير إلى أن مصفوفات CRISPR المصغرة تمثل آلية لاستبعاد العدوى الفوقية غير المتجانسة والمشاركة في التعارضات البينية. [166]

تحرير الجينات كريسبر

تم تطبيق تقنية كريسبر في الصناعات الغذائية والزراعية لهندسة مزارع الكائنات الحية المجهرية وتحصين الثقافات الصناعية (مثل الزبادي) ضد العدوى. كما يتم استخدامه في المحاصيل لتعزيز الغلة وتحمل الجفاف والقيمة الغذائية. [173]

بحلول نهاية عام 2014 ، تم نشر حوالي 1000 ورقة بحثية ذكرت تقنية كريسبر. [174] [175] تم استخدام التكنولوجيا لتعطيل الجينات وظيفيًا في خطوط وخلايا الخلايا البشرية ، للدراسة المبيضات البيض، لتعديل الخمائر المستخدمة في صنع الوقود الحيوي ولتعديل سلالات المحاصيل وراثيًا. [175] صرح هسو وزملاؤه أن القدرة على معالجة التسلسل الجيني تسمح بالهندسة العكسية التي يمكن أن تؤثر إيجابًا على إنتاج الوقود الحيوي [176] كما يمكن استخدام كريسبر لتغيير البعوض حتى لا يتمكن من نقل أمراض مثل الملاريا. [177] تم مؤخرًا استخدام المناهج المستندة إلى كريسبر والتي تستخدم Cas12a في التعديل الناجح لعدد كبير من أنواع النباتات. [178]

في يوليو 2019 ، تم استخدام تقنية كريسبر بشكل تجريبي لعلاج مريض مصاب باضطراب وراثي. كانت المريضة تبلغ من العمر 34 عامًا مصابة بمرض فقر الدم المنجلي. [179]

في فبراير 2020 ، تم إحراز تقدم في علاجات فيروس نقص المناعة البشرية مع إزالة 60-80 ٪ من الحمض النووي في الفئران وبعضها خالي تمامًا من الفيروس بعد تعديلات شملت كل من LASER ART ، وعلاج جديد مضاد للفيروسات ، و CRISPR. [180]

في مارس 2020 ، تم حقن فيروس معدّل بتقنية CRISPR في عين المريض في محاولة لعلاج مرض ليبر الخلقي. [181]

في المستقبل ، يمكن استخدام تحرير الجينات CRISPR لإنشاء أنواع جديدة أو إحياء الأنواع المنقرضة من الأنواع وثيقة الصلة. [182]

أدت عمليات إعادة التقييم المستندة إلى CRISPR للادعاءات المتعلقة بعلاقات الأمراض الجينية إلى اكتشاف حالات شذوذ يحتمل أن تكون مهمة. [183]

كريسبر كأداة تشخيص تحرير

أظهرت النيوكليزات المرتبطة بـ CRISPR أنها مفيدة كأداة للاختبار الجزيئي نظرًا لقدرتها على استهداف تسلسل الحمض النووي على وجه التحديد في خلفية عالية من التسلسلات غير المستهدفة. في عام 2016 ، تم استخدام نوكلياز Cas9 لاستنفاد تسلسلات النوكليوتيدات غير المرغوب فيها في مكتبات تسلسل الجيل التالي بينما تتطلب 250 بيكوغرامًا فقط من إدخال الحمض النووي الريبي الأولي. [184] وابتداءً من عام 2017 ، تم استخدام نوكليازات كريسبر المرتبطة أيضًا للاختبار التشخيصي المباشر للأحماض النووية ، وصولاً إلى حساسية الجزيء المفرد. [185] [186]

من خلال اقتران التشخيصات القائمة على كريسبر بعمليات إنزيمية إضافية ، يمكن اكتشاف الجزيئات التي تتجاوز الأحماض النووية. أحد الأمثلة على التكنولوجيا المقترنة هو التنميط المستند إلى SHERLOCK للنسخ في المختبر (SPRINT). يمكن استخدام SPRINT للكشف عن مجموعة متنوعة من المواد ، مثل المستقلبات في عينات المرضى أو الملوثات في العينات البيئية ، ذات الإنتاجية العالية أو مع أجهزة نقطة الرعاية المحمولة. [187] يتم أيضًا استكشاف منصات كريسبر / كاس للكشف [188] [189] [190] [191] [192] وتعطيل فيروس SARS-CoV-2 ، الفيروس الذي يسبب COVID-19. [193]


تحري

تتيح الشاشات إجراء مسح سريع لأعداد كبيرة من الجينات المرشحة أو المواقع الجينية للمشاركة في المسار أو النمط الظاهري الذي يثير اهتمامك. تتيح التحسينات في تصنيع oligo المُجمَّع ومعالجة البيانات الضخمة ، جنبًا إلى جنب مع كفاءة توصيل الفيروس البطيء ، للباحثين النظر في آلاف الجينات المرشحة في وقت واحد ، إما كمكتبة أو لوحة أكثر تركيزًا. نحن نعرّف المكتبات على أنها مجموعات جينوم كاملة لألواح استنساخ CRISPR هي مجموعات جينية فرعية أصغر. بشكل عام ، يمكن تجميع اللوحات والمكتبات في نسقين: مجمعة (آلاف جرنا في أنبوب واحد) أو مصفوفة (جرنا واحد لكل بئر في 96 طبقًا جيدًا). يقدم كلا النهجين إجابات سريعة على الأسئلة الأكبر ، مما يوفر مزايا كبيرة مقارنة بالطرق السابقة التي تتطلب عملية كثيفة الوقت والعمالة لاستجواب الجينات المرشحة واحدة تلو الأخرى.

نحن نقدم مجموعة متنوعة من حلول الفرز ، بما في ذلك مكتبات GeCKO المجمعة من Broad و Sanger Arrayed Whole Genome Lentiviral CRISPR Library لأداء شاشات خروج المغلوب الجينية الكبيرة (8). وقريبًا ، سيتم تجميع مكتبات وسيط التنشيط التآزري CRISPR / Cas9 للإنسان والفأر (SAM) للفحص على مستوى الجينوم للأنماط الظاهرية لتنشيط النسخ!


المقدمة

أدى تطوير أدوات تحرير الجينوم عالية الدقة مثل نوكليازات المستهدفة إلى تسريع التقدم في علوم النبات الأساسية وتربية المحاصيل (Zhang، Massel، Godwin، & Gao، 2018). متكررات متناوبة قصيرة متباعدة بشكل منتظم (CRISPR) ، والبروتين المرتبط بـ CRISPR (Cas) ، هو نوكلياز موجه من الحمض النووي الريبي تم تطويره من نظام المناعة التكيفية الميكروبية عن طريق تغيير الغرض من أجل تحرير الجينوم (Barrangou & Marraffini ، 2014). يمكن لتقنيات CRISPR-Cas تسهيل هندسة الجينوم الفعالة داخل الخلايا حقيقية النواة (Komor ، Badran ، & Liu ، 2017). يتم تحقيق الاستهداف الدقيق لبروتين Cas9 من خلال تحديد تسلسل استهداف 20 نيوكليوتيد (nt) ضمن الدليل الفردي RNA (sgRNA Ran et al. ، 2013). أصبح تطبيق أدوات تحرير الجينوم مثل CRISPR-Cas9 في الدراسات الوراثية وللمحاصيل الهندسية ذات السمات المرغوبة محورًا رئيسيًا لعلماء النبات ومربي النباتات الدقيقين على حد سواء (بوريل ، 2020). يؤدي تحريض الانقطاعات المزدوجة التي تقطعت بها السبل في الحمض النووي والخاصة بالموقع والإصلاح اللاحق من خلال الربط المباشر أحيانًا إلى حدوث أخطاء مثل عمليات الإدخال أو الحذف (indels) مما يؤدي إلى فقدان وظيفة الجين (خروج المغلوب Rodgers & McVey ، 2016).

القمح المستأنس الحديث هو مشتقات من أحداث التهجين القديمة بين الأجداد السلفية. أكثر أنواع القمح المزروعة على نطاق واسع هما القمح القاسي رباعي الصبغيات أو قمح المعكرونة (Triticum turgidum ssp. دوروم L.) وقمح الخبز سداسي الصبغيات (Triticum aestivum L.) (ماتسوكا ، 2011). كلا النوعين لهما جينومات كبيرة - durum ، ∼12 و hexaploidy ، 16 Gbp - تتكون في الغالب من عناصر متكررة. ضمن هذه الأنواع متعددة الصيغ الصبغية ، يوجد كل جين عادة كنسختين في القمح الصلب رباعي الصبغيات أو ثلاث نسخ في قمح الخبز سداسي الصبغيات. عادةً ما يتم حفظ نسخ الجينات المتجانسة بدرجة عالية في بنية الجينات وتسلسلها بين الجينومات الفرعية (& gt95٪ Adamski et al.، 2020).

كان أول استخدام تم الإبلاغ عنه لـ CRISPR-Cas9 لإنتاج نبات قمح معدل بشكل ثابت في الجينوم هو الضربة القاضية المستهدفة لـ Mildew Locus O (Mlo) ، مما يمنح مقاومة لمسببات البياض الدقيقي. Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt) ، تم تحقيق ذلك بالاقتران مع تقنية تحرير الجينات السابقة ، نوكلياز المستجيب مثل المنشط للنسخ (TALEN Wang et al. ، 2014). منذ هذا التقرير الأول ، تم استهداف جينات القمح ذات الأهمية العلمية الزراعية والأساسية باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 ، مثل جينات α-gliadin لخفض محتوى حبوب الغلوتين (Sánchez-León et al. ، 2018) ، TaGW2 لزيادة وزن الحبوب (تشانغ ، لي ، وآخرون ، 2018) ، TaZIP4-B2 لفهم التقاطع المتماثل الانتصافي (Rey et al. ، 2018) ، TaQsd1 للحد من إنبات ما قبل الحصاد (Abe et al.، 2019) ، TaMTL و CENH3 لتحريض النبات أحادي العدد (Liu et al. ، 2019 Lv et al. ، 2020).

هنا ، نصف البروتوكولات المشتقة تجريبياً لاختيار أهداف سجرنا ، وبناء التجميع ، وتحليل الفرز لتحرير الجينوم في القمح سداسي الصبغيات.


كريسبر كاس: علم الأحياء والآليات والأهمية

طورت بدائيات النوى العديد من آليات الدفاع لحماية نفسها من الحيوانات المفترسة الفيروسية. تُظهِر التكرارات المتناوبة القصيرة المُجمَّعة بانتظام (CRISPR) والبروتينات المرتبطة بها (Cas) نظامًا مناعيًا تكيفيًا بدائي النواة يحفظ العدوى السابقة عن طريق دمج تسلسلات قصيرة من الجينومات الغازية - يطلق عليها الفواصل - في موضع كريسبر. يتم التعبير عن الفواصل المتداخلة مع التكرارات كدليل صغير CRISPR RNAs (crRNAs) التي تستخدمها بروتينات Cas لاستهداف تسلسل الغزاة - على وجه التحديد عند تكرار الإصابة. إن قدرة نظام CRISPR-Cas9 الأدنى على استهداف تسلسل الحمض النووي باستخدام RNAs القابلة للبرمجة قد فتحت طرقًا جديدة في تحرير الجينوم في مجموعة واسعة من الخلايا والكائنات الحية ذات الإمكانات العالية في التطبيقات العلاجية. في حين أن العديد من الدراسات العلمية قد سلطت الضوء على العمليات الكيميائية الحيوية وراء أنظمة CRISPR-Cas ، إلا أن العديد من جوانب خطوات المناعة ، ومع ذلك ، لا تزال تفتقر إلى الفهم الكافي. تلخص هذه المراجعة الاكتشافات الرئيسية في مجال CRISPR-Cas ، وتناقش دور CRISPR-Cas في المناعة بدائية النواة وغيرها من الخصائص الفسيولوجية ، وتصف تطبيقات النظام كتقنية لتحرير الحمض النووي وعامل مضاد للميكروبات.

هذه المقالة جزء من العدد الموضوع تحت عنوان "علم البكتيريا الجديد".

1 المقدمة

نظرًا لكونها أكثر الكيانات وفرة على كوكبنا ، فإن الفيروسات البكتيرية والبدائية (العاثيات أو العاثيات) تعرض تهديدًا مستمرًا للحياة بدائية النواة. من أجل مقاومة العاثيات ، طورت بدائيات النوى عدة استراتيجيات دفاعية. في العقد الماضي ، استحوذ نظام المناعة بدائية النواة CRISPR-Cas (المتجمعة بانتظام بين التكرارات القصيرة المتناظرة - المرتبطة بـ CRISPR) على اهتمام متزايد في المجتمع العلمي ، ليس فقط بسبب طبيعته التكيفية الفريدة ، ولكن أيضًا بسبب إمكاناته العلاجية. تسعى هذه المراجعة إلى تلخيص الاكتشافات الرئيسية التي تم إجراؤها في مجال تقنية CRISPR-Cas ، وتصف الأدوار البيولوجية للنظام في الدفاع المضاد للفيروسات والمسارات البيولوجية الأخرى بالإضافة إلى أهميته للتطبيق الطبي.

كريسبر كاس هو الجهاز المناعي التكيفي الوحيد في بدائيات النوى المعروفة حتى الآن. في هذا النظام ، يتم استخدام الدليل الصغير RNAs (crRNAs) للتداخل الخاص بالتسلسل مع غزو الأحماض النووية. يشتمل CRISPR-Cas على موضع جيني يسمى CRISPR يحتوي على عناصر متكررة قصيرة (مكررة) مفصولة بتسلسلات فريدة (فواصل) ، والتي يمكن أن تنشأ من عناصر وراثية متحركة (MGEs) مثل العاثيات أو الينقولات أو البلازميدات. يسبق ما يسمى بمصفوفة CRISPR تسلسل قائد غني بـ AT وعادة ما تكون محاطة بمجموعة من كاس الجينات المشفرة لبروتينات كاس [1-4]. حتى الآن ، يمكن تقسيم أنظمة CRISPR-Cas إلى فئتين رئيسيتين ، والتي يتم تصنيفها أيضًا إلى ستة أنواع وعدة أنواع فرعية [5-7]. يعتمد التصنيف على حدوث بروتينات Cas المستجيبة التي تنقل المناعة عن طريق شق الأحماض النووية الأجنبية. في أنظمة CRISPR-Cas من الفئة 1 (الأنواع I و III و IV) ، تتكون وحدة المستجيب من مركب متعدد البروتينات بينما تستخدم أنظمة الفئة 2 (الأنواع II و V و VI) بروتين مستجيب واحد فقط [5].

2. الآليات الجزيئية: التكيف والنضج والتداخل

يعمل نظام CRISPR-Cas بطريقة محددة التسلسل من خلال التعرف على الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الغريب وشقهما. يمكن تقسيم آلية الدفاع إلى ثلاث مراحل: (1) التكيف أو اكتساب المباعد ، (2) التكوُّن الحيوي لـ crRNA ، و (3) التداخل المستهدف (الشكل 1).

الشكل 1. نموذج مبسط لآليات المناعة لأنظمة كريسبر-كاس من الفئة 1 والفئة 2. تتكون أنظمة CRISPR-Cas من أ كاس أوبرون (أسهم زرقاء) وصفيف كريسبر يشتمل على تسلسلات متكررة متطابقة (مستطيلات سوداء) تتخللها فواصل مشتقة من الملتهمة (مستطيلات ملونة). عند الإصابة بالعاثية ، يتم دمج تسلسل من الحمض النووي الغازي (protospacer) في مصفوفة CRISPR بواسطة مجمع Cas1 – Cas2. يتم نسخ مصفوفة CRISPR بعد ذلك إلى سلائف طويلة CRISPR RNA (pre-crRNA) ، والتي تتم معالجتها بشكل أكبر بواسطة Cas6 في أنظمة النوع الأول والثالث (المعالجة في أنظمة النوع I-C CRISPR-Cas بواسطة Cas5d). في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الثاني ، يتطلب نضج crRNA tracrRNA و RNase III و Cas9 ، بينما في أنظمة V-A من النوع Cpf1 وحده كافٍ لنضج crRNA. في حالة التداخل لأنظمة النوع الأول ، يتم توجيه Cascade بواسطة crRNA لربط الحمض النووي الغريب بطريقة محددة التسلسل ومن ثم يقوم بتجنيد Cas3 الذي يحط من السلاسل النازحة من خلال نشاطه 3′ –5 حل النواة الخارجية. تستخدم أنظمة النوع III-A والنوع III-B CRISPR-Cas مجمعات Csm و Cmr ، على التوالي ، لتقسيم الحمض النووي (مثلثات حمراء) ونصوصها (مثلثات سوداء). مركب بروتين نووي يتكون من Cas9 و tracrRNA: أهداف مزدوجة crRNA وتشق الحمض النووي الغازي في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الثاني. بروتين المستجيب Cpf1 الموجه من crRNA مسؤول عن التدهور المستهدف في أنظمة النوع الخامس. تمثل المثلثات الحمراء مواقع انشقاق آلية التداخل.

(أ) التكيف

في المرحلة الأولى ، يتم دمج تسلسل متميز من MGE الغازي يسمى protospacer في مصفوفة CRISPR مما ينتج عنه فاصل جديد. يمكّن هذا الحدث الكائن الحي المضيف من حفظ المادة الوراثية للدخيل ويعرض الطبيعة التكيفية لهذا الجهاز المناعي [1]. يبدو أن بروتينين ، Cas1 و Cas2 ، يشتركان في كل مكان في عملية الحصول على المباعد حيث يمكن العثور عليهما في جميع أنواع CRISPR-Cas تقريبًا. الاستثناءات هي أنظمة النوع III-C و III-D و IV CRISPR-Cas ، والتي لا تحتوي على بروتينات متماثلة. علاوة على ذلك ، يُظهر النوع V-C تكوينًا ضئيلًا لأنه يشتمل فقط على بروتين مؤثر مفترض يسمى C2C3 ومتماثل Cas1 [5-7]. في السنوات الماضية ، تم إحراز تقدم كبير في الكشف عن المبادئ الكيميائية الحيوية والجينية لمناعة CRISPR-Cas. ومع ذلك ، لا تزال آلية اقتناء المباعد غير مفهومة تمامًا [8،9]. لا يزال اختيار الكائنات الأولية ومعالجتها قبل التكامل غامضًا على نطاق واسع في العديد من أنواع CRISPR-Cas. ومع ذلك ، فإن النتائج الأخيرة تلقي الضوء على الكيمياء الحيوية لعملية تكامل المباعد. لقد تم إثبات أن Cas1 و Cas2 من النوع I-E من نظام الإشريكية القولونية تشكل معقدًا يعزز تكامل الفواصل الجديدة بطريقة تذكرنا بالعبارات الفيروسية و transposases [10-13]. على الرغم من أن كلا من Cas1 و Cas2 عبارة عن نوكلياز [14-16] ، إلا أن الموقع النشط تحفيزيًا لـ Cas2 يمكن الاستغناء عنه لاكتساب المباعد [10-12]. عادةً ما يتم دمج فاصل جديد عند حد تكرار القائد لمصفوفة كريسبر [1] بينما يتم تكرار أول تكرار للمصفوفة [17 ، 18].

قد يتم الحفاظ على آليات أنواع CRISPR-Cas المختلفة فقط إلى حد معين حيث أظهرت العديد من الدراسات الاختلافات فيما يتعلق بمتطلبات وأهداف آلية التكيف. في حين أن Cas1 و Cas2 كافيان لتعزيز الحصول على المباعد في معظم أنظمة CRISPR-Cas المدروسة من النوع الأول ، فإن النوع I-B يتطلب أيضًا Cas4 للتكيف [19]. نظام I-F CRISPR-Cas من النوع الزائفة الزنجارية بالإضافة إلى ذلك يتطلب آلية التداخل لتعزيز امتصاص الفواصل الجديدة [20]. وبالمثل ، تتطلب أنظمة النوع II-A Csn2 و Cas9 و tracrRNA (عبر تفعيل CRISPR RNA - انظر المزيد من التفاصيل أدناه) للحصول على [1،21،22]. تم الكشف عن وضع تكيف آخر فريد من نوعه حتى الآن لبروتين من النوع III-B Cas1 يتم دمجه في نسخة عكسية. هنا ، تم الإبلاغ عن الحصول على كل من DNA و RNA [23].

إن اختيار التسلسل المستهدف المدمج في موضع كريسبر ليس عشوائيًا.لقد تم إثبات أنه في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الأول والثاني والخامس ، يوجد تسلسل قصير ، يسمى النموذج المجاور الأولي (PAM) ، مباشرة بجوار المسبار الأولي وهو ضروري للاكتساب والتداخل [24-29]. في أنظمة النوع II-A CRISPR-Cas ، يكون مجال التعرف على PAM لـ Cas9 مسؤولاً عن اختيار البروتوسفاسر [21،22]. من المعتقد أنه بعد اختيار البروتوسفاسر ، يقوم Cas9 بتجنيد Cas1 و Cas2 وربما Csn2 لدمج الفاصل الجديد في مجموعة CRISPR. يمكن حفظ هذه الميزة بين جميع أنظمة CRISPR-Cas من الفئة 2 على الرغم من عدم وجود أدلة تجريبية. بالنسبة للنوع I-E ، يعتبر مجمع Cas1 – Cas2 كافيًا لاختيار المباعد والتكامل على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن وجود معقد التداخل يزيد من تواتر المباعدات المتكاملة المجاورة لـ PAM مناسب [24،25]. علاوة على ذلك ، في عملية تسمى التمهيد ، يمكن لآلية التداخل للعديد من أنظمة CRISPR-Cas من النوع الأول أن تحفز الامتصاص المتزايد للفواصل الجديدة عند الارتباط الموجه بـ crRNA إلى فاصل أولي تم اختياره عند الإصابة الأولى [19،25،30]. تعرض هذه العملية وضع تكيف مميز مقارنة بالحصول على فاصل ساذج لأنه يتطلب بشكل صارم فاصل موجود مسبقًا يطابق الهدف. عادة ما يؤدي إلى معدلات اقتناء أعلى من البروتوسبيس التي تقع على مقربة من الموقع المستهدف [25]. ومن المثير للاهتمام ، أن الحصول على المباعد الأولية لا يعتمد على انقسام الهدف لأنه يعمل أيضًا للمواقع المستهدفة المتدهورة التي عادةً ما تؤدي إلى تداخل ضعيف [31]. تظل الآلية الدقيقة غامضة ولكن تم إثبات أن مركب التداخل يمكنه تجنيد Cas1 و Cas2 أثناء الارتباط المستقل لـ PAM بالحمض النووي [32].

(ب) التولد الحيوي

لتمكين المناعة ، يتم نسخ مجموعة CRISPR إلى سلائف طويلة crRNA (pre-crRNA) والتي تتم معالجتها بشكل أكبر في crRNAs دليل ناضج يحتوي على التسلسلات المحفوظة للغزاة [33 ، 34]. في أنظمة النوع الأول والثالث ، يقوم أفراد عائلة Cas6 بتنفيذ خطوة المعالجة مما ينتج عنه أنواع وسيطة من crRNAs محاطة بعلامة قصيرة 5. يتم إعطاء استثناء واحد بواسطة أنظمة النوع I-C ، والتي لا ترمز لبروتينات Cas6. هنا ، يقوم البروتين Cas5d بمعالجة ما قبل crRNA مما ينتج عنه جزيئات crRNA وسيطة بعلامة 11 nt 5 ′ [33،35-38]. يمكن أن يحدث مزيد من التشذيب لنهاية 3 ′ من الرنا الوسيط بواسطة نوكلياز غير معروف وينتج أنواعًا ناضجة من الرنا الريباسي تتكون من جزء فاصل كامل (نهاية 5) وجزء متكرر (3 نهاية) ، والذي عادةً ما يعرض بنية دبوس الشعر في معظم أنظمة النوع الأول [39-41]. يختلف نضج crRNAs في أنظمة CRISPR-Cas من الفئة 2 اختلافًا كبيرًا. في أنظمة النوع الثاني ، يكون tracrRNA مطلوبًا لمعالجة ما قبل crRNA. يتيح التسلسل المضاد للتكرار لهذا الحمض النووي الريبي تشكيل RNA مزدوجًا مع كل تكرار من تكرار pre-crRNA ، والذي يتم تثبيته بواسطة Cas9. ثم يتم التعرف على الازدواج ومعالجته بواسطة مضيف RNase III مما ينتج عنه شكل وسيط من crRNA يخضع لمزيد من النضج بواسطة آلية لا تزال غير معروفة تؤدي إلى الدليل الصغير الناضج RNA [42]. تم اكتشاف آلية مستقلة عن RNase III في نظام النوع II-C CRISPR-Cas النيسرية السحائية. هنا ، تم تحديد تسلسل المحفز لتقع داخل كل تكرار وتمكن البعض من بدء النسخ المؤدي إلى أنواع crRNA وسيطة. على الرغم من معالجة RNase III بوساطة 3 لـ crRNA: لوحظت tracrRNA على الوجهين ، كان من الممكن الاستغناء عنها للتداخل [43]. في نظام V-A CRISPR-Cas من النوع ، ثبت أن Cpf1 له وظيفة مزدوجة أثناء مناعة CRISPR-Cas. يعالج Cpf1 جزيئات crRNAs المبكرة [28] ، وبعد حدث نضوج آخر ذي طبيعة غير معروفة ، يستخدم جزيئات crRNA المُعالجة التي أنتجها لشق الحمض النووي المستهدف [28 ، 29].

(ج) التدخل

في المرحلة الأخيرة من المناعة ، يتم استخدام crRNAs الناضجة كدليل للتدخل بشكل خاص مع الأحماض النووية الغازية. تستخدم أنظمة الفئة 1 مجمعات شبيهة بـ Cascade (مجمع مرتبط بـ CRISPR للدفاع المضاد للفيروسات) لتحقيق تدهور الهدف ، بينما في أنظمة الفئة 2 ، يكون بروتين المستجيب الفردي كافياً للتداخل المستهدف [29،39،44-49]. لتجنب الاستهداف الذاتي ، تتعرف أنظمة النوع الأول والثاني والخامس على وجه التحديد على تسلسل PAM الموجود في المنبع (النوعان الأول والخامس) أو المصب (النوع الثاني) من بروتوسباكر [26،28،29،31،45،50– 52]. في أنظمة النوع الثالث ، يتم تحقيق التمييز بين الذات وغير الذات من خلال علامة 5 من crRNA الناضج ، والتي يجب ألا تتزاوج مع الهدف لتمكين التحلل بواسطة المركب [53].

في أنظمة النوع الأول ، تقوم Cascade بترجمة الحمض النووي الغازي بطريقة تعتمد على crRNA وتجنيد المزيد من nuclease Cas3 للتدهور المستهدف. يحرض Cas3 شقًا على الحمض النووي الغريب وبالتالي يحط من الحمض النووي المستهدف [54،55]. في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الثاني ، يوجه tracrRNA: crRNA duplex بروتين المستجيب Cas9 لإدخال فاصل مزدوج في الحمض النووي الهدف [45]. تشتمل آلية التداخل لأنظمة النوع الثالث على مجمعات Cas10-Csm (النوعان III-A و III-D) و Cas10-Cmr (النوعان III-B و III-C) [5] ، القادرة على استهداف كل من DNA و RNA [ 38،39،47،49،56-63]. من المثير للاهتمام ، أنه ثبت أن تداخل أنظمة النوع III-A والنوع III-B يعتمد على نسخ الحمض النووي الهدف [57،58]. بتعبير أدق ، تشق الوحدة الفرعية Cas10 الحمض النووي بينما تشق Csm3 [59،60] و Cmr4 [61] mRNA المنسوخ في أنظمة النوع III-A والنوع III-B CRISPR-Cas ، على التوالي. يظهر التداخل في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الخامس أوجه تشابه مع التداخل في النوع II. مطلوب RNA مزدوج ، يتكون من tracrRNA و crRNA ، بشكل صارم للانقسام المستهدف في أنظمة النوع V-B [7]. النوع V-A ، مع ذلك ، يستخدم فقط crRNA للتوطين المستهدف والتدهور [28 ، 29].

3. آليات مكافحة كريسبر

تحتوي بدائيات النوى على ترسانة رائعة من استراتيجيات الدفاع من أجل التعايش مع مفترساتها الفيروسية (الإطار 1). كجزء من سباق التسلح المستمر بين البكتيريا ونظيراتها الفيروسية ، طورت العاثيات استراتيجيات مختلفة للتغلب على آليات الدفاع المضادة للفيروسات. تلخص هذه الفقرة البحث حول كيفية تهرب العاثيات من أنظمة كريسبر-كاس.

الإطار 1. كريسبر كاس - ماذا أيضًا؟ (آليات دفاع بديلة بخط عريض)

بصرف النظر عن أنظمة CRISPR-Cas ، طورت بدائيات النوى مجموعة شاملة من آليات الدفاع لحماية نفسها من الحيوانات المفترسة. تبدأ دورة العدوى الفيروسية عن طريق امتصاص العاثية على سطح الخلية البكتيرية ، حيث تتعرف العاثيات على مستقبلات خاصة بالمضيف على الأغشية الخارجية أو جدران الخلايا للمضيف. يمكن للبكتيريا منع امتصاص الملتهمة من خلال إنتاج مصفوفة خارج الخلية تمنع فعليًا الوصول إلى المستقبل المحدد. تتضمن الاستراتيجيات المضادة الأخرى تحور مستقبلات الملتهمة وإنتاج مثبطات تنافسية تشغل المستقبل وبالتالي تؤدي إلى انخفاض القابلية لامتصاص الملتهمة [64-66]. في الخطوة التالية من العدوى ، تقوم العاثيات بحقن مادتها الجينية في العائل. من أجل منع دخول الحمض النووي الفيروسي ، تستخدم البكتيريا ما يسمى استبعاد العدوى الفائقة (Sie) الأنظمة التي غالبًا ما يتم ترميزها بواسطة prophages. تتكون هذه الأنظمة من مجموعة من البروتينات التي تمنع انتقال دنا الملتهمة إلى السيتوبلازم [67،68].

بمجرد إدخاله ، يمكن أن يتحلل الحمض النووي الفيروسي بواسطة تعديل التقييد (RM) الأنظمة التي تستخدم نوكليازات للتعرف على الأشكال القصيرة الموجودة على الحمض النووي الغازي وتشقّقها. يتم التعرف على الحمض النووي غير الميثلي بواسطة هذه الإنزيمات المقيدة ويتم منع الانقسام الذاتي عن طريق مثيلة المواقع المستهدفة على جينوم المضيف [69،70]. هناك استراتيجية دفاعية أخرى تمنع انتشار العاثيات عن طريق التضحية بالخلية المضيفة المصابة ، وبالتالي حماية التجمعات البكتيرية. هؤلاء عدوى فاشلة (أبي) تستخدم الآليات البروتينات التي تشعر بالعدوى وبالتالي تحفز موت الخلايا من خلال ، على سبيل المثال. إزالة استقطاب الغشاء ، تثبيط الجهاز الانتقالي للمضيف أو استغلال مكونات أنظمة مضاد السموم [71-74]. تشمل الأنظمة المضادة للفيروسات الأقل تميزًا استبعاد العاثيات (BREX) وبدائية النواة أرجونوتس. بينما يمنع BREX التكاثر الفيروسي وتكامل الحمض النووي للعاقمات اللايسوجينية [75] ، فإن بروتينات الأرجونوت هي نوكلياز موجه من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الذي يشق الدنا الغازي بطريقة محددة التسلسل [76-78].

يمكن للعاقمات الهروب من آلية التداخل CRISPR-Cas من خلال الطفرات العشوائية في منطقة البروتوسفاسر أو تسلسل PAM [26،51]. كإستراتيجية مضادة ، تُظهر العديد من أنظمة CRISPR-Cas من النوع الأول امتصاصًا مرتفعًا للفواصل الجديدة كنتيجة مباشرة لعدم التطابق في PAM أو في الفاصل الأولي المستهدف أثناء الاستحواذ الجاهز (انظر الفقرة 2). علاوة على ذلك ، فإن كفاءة الهروب من مناعة CRISPR-Cas عن طريق الطفرات النقطية ضعيفة بشدة في التجمعات البكتيرية التي تظهر تنوعًا فاصلًا عاليًا. التفسير المحتمل لهذه الملاحظة هو أن تنوع المباعد يزيد من الضغط التكيفي على الفيروس وبالتالي يؤدي إلى الانقراض السريع للمفترس [79].

أظهرت الدراسات الحديثة أن العاثيات التي تشبه مو والتي تصيب الزائفة الزنجارية، تعمل بنشاط على تثبيط أنظمة CRISPR-Cas الخاصة بمضيفهم. تنتج هذه العاثيات بروتينات مضادة لـ CRISPR (Acr) تتفاعل مع مكونات آلية التداخل من النوع IF CRISPR-Cas: على سبيل المثال ترتبط بروتينات الملتهمة AcrF1 و AcrF2 بوحدات فرعية مختلفة من Cascade وبالتالي تمنع ارتباط مجمع Csy بالحمض النووي المستهدف. ثبت أن AcrF3 يربط نوكلياز Cas3 ، مما يثبط وظيفته في تدهور الهدف. تم العثور على بروتينات مماثلة لمنع مناعة النوع I-E CRISPR-Cas في نفس الكائن الحي ، مما يثير التساؤل عما إذا كانت بروتينات Acr موجودة لأنواع CRISPR-Cas الأخرى [20،80-82].

في تقرير فريد حتى الآن عن التهرب المناعي ، تم إثبات ذلك ضمة الكوليرا تقوم عاثيات ICP1 بتشفير نظام I-F CRISPR-Cas من النوع I-F CRISPR-Cas الذي يستهدف جزيرة جينوم مضيفة ، والمعروف عنها أنها متورطة في دفاع مضاد للعاثيات لا علاقة له بـ CRISPR. كانت مهاجمة آلية دفاع المضيف أمرًا حاسمًا لانتشار العاثيات حيث تم تقليل كفاءة العدوى بشكل كبير عند حذف الفواصل في مصفوفة كريسبر الفيروسية. ومن المثير للاهتمام أن تحليل العاثيات التي ما زالت قادرة على إصابة المضيف بنجاح قد اكتسب فواصل جديدة نشأت من نفس الموضع الجينومي ، مما يُظهر أن الفيروس يحتوي على نظام CRISPR-Cas يعمل بكامل طاقته وهو نشط أيضًا في اكتسابه [83].

4. ما وراء المناعة التكيفية

إلى جانب دورها في المناعة بدائية النواة ، فقد ثبت أن أنظمة CRISPR-Cas تشارك في المسارات الخلوية بخلاف المناعة.

(أ) إصلاح الحمض النووي

أشارت التقارير المبكرة إلى تورط بكتريا قولونية بروتين Cas1 في مسارات إصلاح الحمض النووي منذ أن ثبت أن البروتين يتفاعل مع مكونات آلية الإصلاح الخلوي مثل RecB و RecC و RuvB. يعالج Cas1 أيضًا هياكل DNA الوسيطة التي تحدث غالبًا أثناء إصلاح الحمض النووي وإعادة التركيب مثل تقاطعات Holliday وشوكات النسخ المتماثل و 5-flaps. علاوة على ذلك ، يتم حذف ملفات CAS1 أدى الجين إلى زيادة الحساسية تجاه تلف الحمض النووي وأثر على فصل الكروموسومات [14]. علاوة على ذلك ، أصبحت مشاركة نظام إعادة التركيب RecBCD في مناعة CRISPR-Cas أكثر وضوحًا في السنوات الأخيرة. يتعرف مجمع RecBCD على فواصل الحمض النووي المزدوج (dsDNA) التي تحدث غالبًا عند شوكات النسخ المتماثل. بعد التعرف على الحمض النووي التالف ، يقوم RecBCD لاحقًا بتحطيم الحمض النووي حتى يصل إلى موقع تشي [84]. اقترحت دراسة حديثة أن منتجات التدهور لمجمع الإصلاح تعمل كقوالب لاقتناء المباعد حيث تم الحصول على فواصل جديدة بشكل أساسي من مناطق تقع بالقرب من شوكات النسخ المتوقفة المتوقفة. فيما يتعلق بالمناعة المضادة للفيروسات ، قد يكون RecBCD هو خط الدفاع الأول لأنه يتعرف على الحمض النووي للعاثية الخطية ويحللها ، وبالتالي يمكّن آلية التكيف من جمع فواصل جديدة. يتم منع الحصول على الحمض النووي الكروموسومي بسبب التوزيع المتكرر لمواقع تشي داخل جينوم المضيف [85]. تم إثبات متطلبات RecB لمناعة النوع I-E CRISPR-Cas في نهاية المطاف من خلال دراسة أخرى توضح أن أ recB ألغى الحذف الاستحواذ الساذج فاصل في بكتريا قولونية. ومن المثير للاهتمام ، أن غياب RecB لم يؤثر على اقتناء المباعد الأولية. هنا ، كانت الهليكازات RecG و PriA ضرورية ، في حين كان DNA polymerase I ضروريًا لكل من التكيف الساذج والمجهز [86]. يقترح النموذج الذي ظهر أنه ، أثناء التكيف المسبق ، يتعرف RecG و PriA على بنية R-loop التي تحدث عن طريق ربط مجمع Cascade: crRNA بالحمض النووي. نتيجة لذلك ، ينفصل Cascade عن الحمض النووي مما يؤدي إلى التعرض لمناطق الحمض النووي أحادية السلسلة المؤقتة التي قد تحفز الحصول على المباعد بواسطة Cas1 و Cas2. نظرًا لأن Cas3 ضروري للتكيف المسبق ، فمن المرجح أن يعزز نشاط نوكلياز البروتين توليد شظايا الحمض النووي التي يتم التقاطها بواسطة آلية الاستحواذ. أثناء التكيف الساذج ، من المحتمل أن يتسبب Cas1 في تلف الحمض النووي ويؤدي إلى تجنيد مجمع RecBCD كما هو موضح أعلاه [85،86].

(ب) تنظيم الجينات

أصبحت مشاركة مكونات CRISPR-Cas في العمليات التنظيمية الخلوية أكثر وضوحًا في السنوات القليلة الماضية. يبدو أن أنظمة النوع الثاني CRISPR-Cas تلعب دورًا مهمًا في تنظيم ضراوة البكتيريا المسببة للأمراض. في فرانسيسيلا نوفيسيدا، مركب بروتين نووي يتكون من Cas9 و tracrRNA و RNA صغير فريد مرتبط بكريسبر يقمع التعبير عن البروتين الدهني البكتيري (BLP). يعد تقليل التنظيم النسخي لـ BLP أمرًا حاسمًا للتهرب المناعي حيث يمكن التعرف على البروتين بواسطة جهاز المناعة في المضيف. من المفترض أن مجمع البروتين النووي يربط blp نسخة تؤدي إلى تدهور mRNA بواسطة Cas9 أو نوكلياز غير معروف. نتيجة لذلك ، يتم تمثيل BLP بشكل ناقص على سطح الخلية مما يؤدي إلى انخفاض الاستجابة المناعية [87]. بصورة مماثلة، النيسرية السحائية سلالات متحولة تفتقر إلى كاس 9 أظهر الجين عيوبًا شديدة في البقاء على قيد الحياة في الخلايا الظهارية البشرية [87]. في العطيفة الصائمية, كاس 9 أظهرت طفرات الحذف سمية خلوية أقل في خطوط الخلايا البشرية. يفترض ، عدم وجود C. jejuni يؤثر Cas9 على التركيب الكيميائي الحيوي لجدار الخلية البكتيرية وبالتالي يجعل الخلية أكثر عرضة لارتباط الأجسام المضادة [88]. بروتين من النوع II-B Cas2 من البكتيريا المستروحة كان حاسمًا في إصابة الأميبات ، وبالتالي يمثل وظيفة أخرى مرتبطة بالفوعة [89]. نسخ مصفوفة CRISPR مهجورة (لا كاس operon) في الليسترية المستوحدة يؤدي إلى استقرار mRNA المطابق جزئيًا. ومن المثير للاهتمام ، أنه إذا تمت إزالة مصفوفة كريسبر من الجينوم ، فإن البكتيريا كانت قادرة على استعمار كبد الفئران بشكل أكثر كفاءة لتقديم دليل على وظيفة تنظيمية في الفوعة بواسطة آلية الحمض النووي الريبي المضادة للحساسية [90].

يمكن أن يؤثر التنظيم الداخلي المنشأ بواسطة CRISPR-Cas أيضًا على سلوك المجموعة في مجموعة البكتيريا على النحو المحدد في دورة حياة Myxococcus xanthus. إن δ-preoteobacterium قادرة على إنتاج myxospores للتغلب على الضغوط البيئية مثل نقص المغذيات. يتم إنتاج Myxospores خلال عملية معقدة تنطوي على حركة تعاونية وتجميع الخلايا داخل مجموعة سكانية. نتيجة لذلك ، تتمايز تجمعات الخلايا إلى ما يسمى بالأجسام الثمرية التي تحتوي على الأبواغ. Myxococcus xanthus يمتلك نظام I-C CRISPR-Cas وعمليات حذف كاس 7 و كاس 5 يؤدي إلى انخفاض شديد في التبويض. كان الشيء نفسه صحيحًا بالنسبة لـ كاس 8 ج الحذف الذي أدى بالإضافة إلى ذلك إلى تأخير تجميع الخلايا. علاوة على ذلك ، يحفز Cas8c تخليق FruA ، وهو بروتين مهم في مسار التبويض [91-93]. لا تزال المشاركة الميكانيكية لبروتينات كاس في تكوين الجسم المثمر محيرة حيث أضافت دراسة حديثة مستوى آخر من التعقيد من خلال إظهار مشاركة مجموعة من النوع III-B CRISPR في تنمية الجسم المثمر وإنتاج عديدات السكاريد الخارجية [94].

(ج) تطور الجينوم

يعد الحصول على فواصل الحمض النووي الأجنبية خطوة حاسمة في مناعة CRISPR-Cas ويعرض الطبيعة التكيفية الفريدة لنظام الدفاع هذا. تم الإبلاغ على نطاق واسع أنه في بعض الحالات ، يتم اشتقاق المباعدات من التسلسلات الجينية الخاصة. ومع ذلك ، فإن استهداف الكروموسوم يؤدي إلى تلف الحمض النووي وسيقتل حتما الخلية البكتيرية. في حين أن الاستهداف الذاتي لأنظمة CRISPR-Cas يمكن أن يكون بالتأكيد مميتًا للكائن الحي المضيف ، فقد بحثت العديد من الدراسات في دورها المحتمل في تطور الجينوم. إلى جانب التعديلات الجينية صغيرة الحجم مثل الطفرات في تسلسل الكروموسومات PAM ، أو البروتوسفات أو كاس أوبرون ، لوحظت عمليات إعادة ترتيب جينومية كبيرة في بكتوبكتيريوم atrosepticum عندما تتطابق الفواصل مع تسلسلات في الجينوم الخاص. هنا ، تمت إعادة تشكيل أو حذف جزيرة جينومية تبلغ مساحتها حوالي 100 كيلو بايت تشارك في إمراضية النبات [95]. دراسة الجينوم على Thermotogales كشفت عن ارتباط مواقع كريسبر بمواقع انقلابات الحمض النووي وإعادة الترتيب الجيني الأخرى. على الرغم من أن المشاركة الدقيقة لمصفوفات CRISPR في تعزيز التغيرات الجينية المرصودة لا تزال غير معروفة ، يبدو أن تقنية CRISPR تعزز هذه الأحداث التطورية [96]. على النقيض من ذلك ، اقترحت إحدى دراسات المعلومات الحيوية أن الاستهداف الذاتي لأنظمة CRISPR-Cas هو تأثير غير مرغوب فيه إلى حد ما ، لأنه ينقل المناعة الذاتية. نتيجة لذلك ، تتدهور أنظمة CRISPR-Cas بسبب الطفرات في كاس الجينات والمواقع المستهدفة أو عن طريق تعطيل أو حذف أنظمة CRISPR-Cas الكاملة التي تعزز بالفعل الاختلافات التطورية ولكنها تؤدي في نفس الوقت إلى فقدان اللياقة فيما يتعلق بالدفاع المضاد للفيروسات [97].

5. الأهمية والتطبيقات

أصبح استخدام تقنية CRISPR-Cas في الأساليب العلاجية ذات أهمية متزايدة في مجالات الطب المختلفة. تم استغلال وجود التسلسلات المتكررة التي تتخللها فواصل قصيرة ، والتي عُرفت لاحقًا باسم CRISPR ، لأغراض التشخيص والكتابة البسيطة لـ السل الفطري سلالات [98]. ساعد هذا في فهم الطرق التي تستخدمها مسببات الأمراض لانتقالها من خلال النظر في الاختلافات في محتوى المباعدة للسلالات ذات الصلة [98 ، 99]. هذا ما يسمى spoligotyping (spoligotyping) تم تكييفه أيضًا من أجله السالمونيلا المعوية, يرسينيا بيستيس و الوتدية الخناق [100–105].

تمت دراسة استخدام كريسبر-كاس كأداة مباشرة لمضادات الميكروبات مؤخرًا. تم تصميم مصفوفات CRISPR الاصطناعية لقتل البكتيريا المسببة للأمراض من خلال استهداف مقاومة المضادات الحيوية أو جينات الفوعة. تهدف هذه الطريقة الأنيقة فقط إلى السلالات الضارة في التجمعات البكتيرية وتسمح للسلالات غير المسببة للأمراض بالتغلب على مسببات الأمراض [106-108]. استخدمت دراسة حديثة العاثيات اللايسوجينية لإدخال نظام CRISPR-Cas في بكتريا قولونيةالذي يستهدف الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. تم تصميم المصفوفة لتستهدف بالإضافة إلى ذلك جينومات العاثيات المحللة التي تؤدي إلى مناعة ضد العاثيات فقط للبكتيريا الحساسة للمضادات الحيوية. بتعبير أدق ، البكتيريا التي من غير المرجح أن تكتسب جينات مقاومة للمضادات الحيوية بسبب محتواها من المباعدة المهندسة هي أيضًا مقاومة للعاقمات اللاكتية. وبالتالي ، في حالة الإصابة بالعاثيات ، سيتم استئصال السلالات المسببة للأمراض فقط من السكان [109].

تتجاوز الإمكانات الطبية لأنظمة CRISPR-Cas العلاج بمضادات الميكروبات. يُظهر إدخال تعديلات فعالة ودقيقة في جينات الكائن الحي الأساس لهندسة الجينوم. تستخدم نوكليازات قابلة للبرمجة والتي تربط المناطق الجينومية على وجه التحديد وتشق الحمض النووي في الموضع المطلوب. تم استخدام نوكلياز إصبع الزنك (ZFN) ونوكلييز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs) على نطاق واسع لتحرير الحمض النووي. تعتمد كلتا أداتي تحرير الجينوم على نفس المبدأ: يتم دمج مجال ربط الحمض النووي الخاص بالتسلسل ، والذي يوفر الخصوصية ، في نوكلياز. نظرًا لبساطته وفعاليته وإمكانية استهداف مواقع جينية متعددة في وقت واحد ، يفضل استخدام نظام CRISPR-Cas9 على أنظمة ZFN و TALEN [110-112]. يستخدم بروتين الدفاع البكتيري Cas9 لاستهداف أي تسلسل DNA مرغوب فيه تقريبًا بمساعدة RNA مستهدف. هذا الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA) هو مزيج هندسي من tracrRNA الذي يحدث بشكل طبيعي: crRNA مزدوج وبالتالي يبسط تطبيقه لأغراض تحرير الجينوم [45].

إن إعادة استخدام نظام CRISPR-Cas9 لتحرير الجينوم يستغل آليات إصلاح الحمض النووي للخلايا حقيقية النواة: بعد إدخال كسر DNA مزدوج الشريطة ، يمكن للخلية إصلاح الضرر عن طريق الانضمام غير المتماثل (NHEJ). هذه العملية عرضة للخطأ وغالبًا ما تؤدي إلى طفرات نقطية أو حذف أو تسبب تغيرات في الإطارات تعمل على تغيير منتج الجين وإلغاء وظيفته في النهاية ، والتي يفضلها الضربة القاضية الجينية. ومع ذلك ، تعتمد هندسة الجينوم الدقيقة على مسار آخر ، يسمى الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) ، حيث يتم استخدام قطعة من الحمض النووي تُظهر التماثل المتسلسل للموقع المستهدف لإصلاح الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل. يمكن أن يحتوي تسلسل الحمض النووي القصير هذا على أي نوع من الإدخال أو التغيير ، مما يسمح بدمج أي تسلسل DNA مرغوب فيه في الموقع المستهدف [50،113-117] (الشكل 2أ).

الشكل 2. تطبيقات تقنية CRISPR-Cas9. (أيتم توجيه Cas9 بواسطة sgRNA للحث على كسر الحمض النووي مزدوج الشريطة في موضع الجينوم المطلوب. يمكن إصلاح تلف الحمض النووي عن طريق NHEJ مما ينتج عنه عمليات إدخال أو حذف عشوائية قصيرة في الموقع المستهدف. بدلاً من ذلك ، يمكن إدخال تسلسل DNA الذي يُظهر التكامل الجزئي للموقع المستهدف أثناء HDR لأغراض تحرير الجينوم الدقيق. (ب) تؤدي الطفرات في المجالات التحفيزية لـ Cas9 إلى متغير ميت (dCas9) يربط الحمض النووي ولكنه لا يشقّه. يتم استخدام النهج مع dCas9 لقمع النسخ عن طريق الارتباط بمنطقة المروج للجين وبالتالي منع الوصول إلى بوليميراز الحمض النووي الريبي. وبالمثل ، يمكن دمج dCas9 في القامع النسخي. تمثل الصلبان الحمراء تثبيط النسخ. (جيحفز اندماج dCas9 مع المنشط النسخي نسخ الجين المجاور عن طريق تجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي.

تؤدي الطفرات في أشكال نوكلياز لـ Cas9 إلى متغير "ميت" غير قادر على شق الحمض النووي وبالتالي يمكن استخدامه لتنظيم نسخ الجين المرغوب. من خلال استهداف منطقة المروج أو إطار القراءة المفتوح للجين ، يتم حظر ارتباط بوليميريز الحمض النووي الريبي فعليًا وتمنع استطالة الرنا المرسال. وبدلاً من ذلك ، يمكن دمج dCas9 في مثبط يتحكم في نسخ الجينات (الشكل 2ب). يمكن تحقيق التنشيط النسخي عن طريق دمج dCas9 في منشط النسخ الذي يجند بوليميراز الحمض النووي الريبي ويحفز التعبير الجيني (الشكل 2)ج). في بعض الحالات ، تكون الضربات الجينية مرغوبة أكثر من الضربات الجينية ، على سبيل المثال إذا كان الجين المستهدف ضروريًا [116،118-122]. تم أيضًا استغلال طريقة CRISPR-Cas9 لتحرير الإبيجينوم الذي يسمح بالتحكم في التعبير الجيني عن طريق إدخال تعديلات مثل مثيلة الحمض النووي أو أستلة هيستون. أظهرت إحدى الدراسات أن بروتين الاندماج لـ dCas9 والمجال الأساسي لـ acetyltransferase p300 البشري يمكن أن ينشط التعبير الجيني في مواقع محددة [123]. علاوة على ذلك ، كان اندماج dCas9 مع مثبط KRAB قادرًا على تحفيز المثيلة في معززات محددة مما أدى إلى انخفاض إمكانية الوصول إلى الكروماتين ، وبالتالي إسكات التعبير الجيني [124]. يتمتع التحرير الدقيق للإبيجينوم بإمكانية كبيرة للكشف عن تعديل الكروماتين الخاص بالموقع ويساعد على استكشاف تنظيم التعبير الجيني الذي يمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات علاجية جديدة. الأساليب الأخرى - بشكل رئيسي في بدائيات النوى - تستغل النوع الداخلي من معقد المستجيب Cascade لإجراء تجارب مماثلة إذا كان نوكلياز Cas3 غائبًا [125-127]. في جميع استراتيجيات التلاعب بالجينوم المذكورة أعلاه ، يعد وجود PAM بجوار الموقع المستهدف مطلبًا صارمًا [9].

يمكن استخدام إعادة التشكيل الدقيقة للجينوم لعلاج المتغيرات الجينية التي تسبب الأمراض الوراثية. تمكن العلماء من إصلاح الطفرات التي تسبب التليف الكيسي (CF) عن طريق تصحيح cftr موضع في الخلايا الجذعية المعوية المزروعة لمرضى التليف الكيسي [128]. علاوة على ذلك ، باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 ، يمكن استعادة النمط الظاهري الصحي في الفئران التي تعاني من التيروزينيميا الوراثية ، وهو مرض وراثي يسبب تلفًا حادًا في الكبد [129]. تم استخدام تحرير الجينوم بشكل أكبر لتطوير مناهج علاجية مضادة للفيروسات. وفقًا لذلك ، تم بنجاح استئصال جينوم فيروس نقص المناعة البشرية من الخلايا المصابة بالعدوى الكامنة [130]. في الواقع ، أظهرت دراسة حديثة أن توليد الطفرات التي يسببها NHEJ في الجينوم الفيروسي أدى إلى عيوب تكرار الفيروس. ومع ذلك ، فقد أدى أيضًا إلى توليد طفرات مختصة بالنسخ المتماثل والتي تأوي الطفرات في الموقع المستهدف وبالتالي لم تعد مستهدفة من قبل Cas9 [131]. تهدف دراسات أخرى إلى تغيير بروتين سطحي معين يسمى CCR5 يعمل كمستقبل مشترك لفيروس HI لدخول خلية مضيفة. الطفرات في سي سي آر 5 يمكن للجين أن يمنع الفيروس من إصابة خلية مما يؤدي إلى نمط ظاهري شديد المقاومة ولكنه صحي. في الواقع ، تغيير النوع البري سي سي آر 5 يؤدي الجين إلى مناعة الخلايا الوحيدة والبلاعم ضد عدوى فيروس العوز المناعي البشري [132-134].

تعمل تقنية CRISPR-Cas9 على تبسيط شاشات مقياس الجينوم بشكل أكبر. تسعى هذه الشاشات إلى تحديد الجينات التي تشارك في بعض العمليات الأيضية أو الممرضة عن طريق إلغاء وظيفة الجين ودراسة النمط الظاهري الناتج. باستخدام هذا النهج ، يمكن تحديد الجينات التي تشارك في نمو الورم [135] أو تنقل القابلية للسموم البكتيرية [136]. في السابق ، تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) للتخلص من التعبير الجيني بطريقة خاصة بالتسلسل. ومع ذلك ، فإن RNAi يقلل فقط من وفرة النصوص ، في حين أن CRISPR-Cas9 يتيح الضربة القاضية الكاملة للجينات المرشحة. علاوة على ذلك ، يعد تعدد الإرسال (استهداف العديد من المواقع الجينية في نفس الوقت) أمرًا بالغ الأهمية لهذا النهج ويمكن تحقيقه باستخدام مكتبة من sgRNAs المختلفة التي يتم تسليمها عادةً مع Cas9 بواسطة نظام ناقل بطني [135-138].

6. وجهات نظر

ازداد الاهتمام بمجال كريسبر-كاس بسرعة في السنوات الأخيرة. ألقت العديد من الدراسات الضوء على العمليات الجينية والكيميائية الحيوية الكامنة وراء الجهاز المناعي بدائية النواة التكيفية ، وبالتالي كشفت عن إمكاناته في الطب الحديث (الإطار 2). مما لا شك فيه أن تعدد استخدامات أنظمة CRISPR-Cas المختلفة مذهل ومع الاكتشاف الأخير لثلاثة أنواع جديدة ربما بدأنا للتو في فهم أهمية CRISPR-Cas تمامًا كنظام دفاع ميكروبي. ومع ذلك ، فإن العديد من جوانب النظام المضاد للفيروسات تتطلب مزيدًا من التبصر. لا تزال عملية التحصين التي يتم إنجازها من خلال دمج فواصل جديدة في مجموعة CRISPR هي الحدث الأكثر إثارة للحيرة في مناعة CRISPR-Cas. لم يتم الكشف عن الأساس الكيميائي الحيوي الدقيق لاكتساب المباعد ودرجة حفظها بين الأنواع المختلفة. على سبيل المثال ، تحتاج وظيفة البروتينات الإضافية مثل Cas4 و Csn2 التي ثبت أنها ضرورية للتكيف إلى مزيد من التحقيق. تمت ملاحظة التكيف الأولي فقط في أنظمة CRISPR-Cas من النوع الأول على الرغم من أن هذه العملية توفر ميزة وقائية كبيرة تجاه العاثيات الطافرة التي من شأنها أن تفلت من تداخل CRISPR.

الإطار 2. المعالم البارزة في أبحاث كريسبر-كاس.

تم وصفها لأول مرة في عام 1987 على أنها متواليات متكررة غير معتادة [139] ، وزاد الاهتمام بكريسبر والجينات المرتبطة بها ببطء خلال التسعينيات وأوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين. كان يعتقد في البداية أنه يشارك في إصلاح الحمض النووي الخلوي وعمليات تقسيم النسخ المتماثل ، وأول دليل على أن أنظمة CRISPR-Cas تعرض نظامًا مناعيًا بدائي النواة متكيفًا تم تسليمه في عام 2005 [4]. تفاجأ الباحثون عندما اكتشفوا أن معظم التسلسلات المتناثرة تتداخل بين التكرارات المتطابقة المستمدة من الحمض النووي الصبغي الإضافي ، وبشكل أكثر تحديدًا من جينومات العاثيات والبلازميدات المقترنة [4100.140]. تم إثبات الفرضية في النهاية بعد عامين عندما أظهر العلماء دمج فواصل جديدة في موقع CRISPR-Cas لـ العقدية الحرارية بعد تحدي البكتيريا بالعاثية. أظهرت الفواصل المكتسبة حديثًا دائمًا تكاملًا مثاليًا للتسلسلات الموجودة على جينوم الملتهمة ونقل المقاومة تجاه تلك العاثية المعينة عند الإصابة اللاحقة [1]. سرعان ما تسارع الاهتمام البحثي في ​​مجال كريسبر ، مما أدى إلى اكتشافات جديدة ساعدت في فهم الآليات الأساسية لجهاز المناعة. في عام 2008 ، تمت معالجة نسخة CRISPR في crRNAs ناضجة التي توجه مجمع Cascade لـ بكتريا قولونية تم التحقق من صحة نظام النوع I-E تجريبيًا ، مما يعطي أيضًا تلميحات إلى أن DNA بدلاً من RNA مستهدف [54]. تم تأكيد هذا الأخير في نفس العام حيث أظهرت دراسة أن الحمض النووي هو بالفعل الجزيء المستهدف [56]. دفع هذا العلماء إلى التفكير في الدور المحتمل الذي قد يلعبه الجهاز المناعي بدائية النواة كأداة لمعالجة الحمض النووي. اليوم ، تعد CRISPR-Cas9 أداة يتم تسخيرها بشكل متكرر لأغراض تحرير الجينوم وتم تقديم تقدم كبير في فهم العمليات الكيميائية الحيوية الأساسية في Cas9 الموجه بالـ RNA في السنوات الأخيرة. في عام 2010 ، أظهر الباحثون أن Cas9 يخلق كسرًا فرديًا مزدوج الشريطة في موضع محدد على الحمض النووي المستهدف [63]. تم تقديم نظرة ثاقبة للآلية بعد عام واحد حيث تم عرض مشاركة RNA صغير آخر ، يسمى tracrRNA. نضج كرنا يتطلب tracrRNA وكذلك Cas9 و RNase III [42]. تم إثبات الدليل على أن النظام سيعمل بشكل غير متجانس في البكتيريا الأخرى في عام 2011 ، مثل S. ثيرموفيلوس يمكن أن يوفر نظام CRISPR-Cas من النوع الثاني مناعة في بكتريا قولونية [141]. أظهرت أبحاث أخرى عناصر معينة من نظام النوع الثاني ، بما في ذلك تورط تسلسل PAM في التداخل [6،26،141] لكن طبيعة مجمع الانقسام ظلت غير معروفة. في عام 2012 ، تبين أن tracrRNA ، التي كانت معروفة سابقًا بالمشاركة في نضوج crRNA ، تشكل أيضًا جزءًا أساسيًا من معقد انشقاق الحمض النووي ، مع tracrRNA المزدوج: crRNA يوجه Cas9 لإدخال فواصل مزدوجة الخيط في الهدف DNA [45]. تم تحقيق مزيد من التبسيط للاستهداف المبرمج من خلال إنشاء اندماج الحمض النووي الريبي أحادي الدليل لـ tracrRNA و crRNA ، والذي يوجه Cas9 لانقسام الحمض النووي الخاص بالتسلسل [45]. بعد بضعة أشهر من وصف تقنية CRISPR-Cas9 [45] ، أظهر عدد من المنشورات قوتها في تحرير الجينومات في الخلايا والكائنات حقيقية النواة ، بما في ذلك خلايا الإنسان والفأر [116،117].

جانب آخر محير هو تأثير أنظمة CRISPR-Cas على التنوع بدائيات النواة. لقد لوحظ أن أجهزة المناعة لا تحمي فقط من العاثيات ، ولكن أيضًا ضد الجسيمات MGE الأخرى التي قد يكون لها آثار مفيدة للكائن الحي. في الواقع ، تم إسكات نظام CRISPR-Cas الأصلي في بكتريا قولونية بواسطة بروتين هيكلي نووي شبيه بالهيستون H-NS [142] ، مما يثير فكرة أن النظام غير النشط قد يكون مفيدًا للبكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتداخل أنظمة CRISPR-Cas مع اقتران البلازميد وتحويل البكتيريا ذات الكفاءة الطبيعية [43،143]. تظهر العديد من الدراسات ارتباطًا سلبيًا بين حدوث أنظمة CRISPR-Cas ومقدار MGEs داخل الكروموسوم ، والذي يبدو وكأنه قيد على العمليات التطورية ونقل الجينات الأفقي (HGT) [144،145]. تم تقديم نتائج متناقضة من خلال تحليل تطوري لم يعثر على ارتباط مهم بين نشاط نظام CRISPR-Cas وعدد أحداث HGT [146]. ومع ذلك ، يجب تقييم هذه العلاقات في سياق مع عوامل أخرى مثل الضغط المفترس ، وحدوث أنظمة دفاع أخرى وتكاليف اللياقة المرتبطة بالحفاظ على الدفاع التكيفي. لقد تم ذكر أن البكتيريا قد تفقد أو تعطل أنظمة CRISPR-Cas الخاصة بها عندما تواجه وفرة كبيرة من الحيوانات المفترسة. في مثل هذه البيئات ، تبدو مقاومة العاثيات بسبب ، على سبيل المثال ، طفرات المستقبلات أكثر سهولة [147]. بتعبير أدق ، فإن معدلات الطفرات الفيروسية العالية تجعل المناعة التكيفية عفا عليها الزمن لأن تكاليف التكيف مع موطن مفترس ديناميكي تتجاوز الفوائد المناعية [148]. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت دراسة أخرى أن مجرد الحفاظ على نظام CRISPR-Cas دون أي ضغط مفترس يمكن أن يؤدي إلى توازن سلبي فيما يتعلق بتكاليف اللياقة البدنية. هنا ، أظهرت سلالة من النوع البري قدرات تنافسية منخفضة مقارنةً بـ كاس الجين بالضربة القاضية متحولة. ومع ذلك ، في حالة عدوى الملتهمة ، لم يلاحظ أي زيادة في تكاليف اللياقة كما هو موصوف أعلاه ، مما يدل على أن هذه التفاعلات الديناميكية بين العاثيات والمضيف معقدة للغاية وتحتاج إلى مزيد من التفصيل في العمل العلمي في المستقبل.

مطلوب أيضًا مزيد من البحث حول الوظائف غير المرتبطة بالحصانة لأنظمة CRISPR-Cas. كشفت العديد من الدراسات عن مشاركتها في العديد من العمليات التنظيمية (انظر الفقرة 4) وهناك حاجة إلى رؤية أعمق ، على سبيل المثال ، عندما يتعلق الأمر بتفاعل بروتينات Cas مع مكونات مسارات إصلاح الحمض النووي الخلوي وإعادة التركيب.

إلى جانب دورها الرائع في بدائيات النوى ، جذبت أنظمة كريسبر-كاس بلا شك معظم الاهتمام لإمكانياتها في التطبيقات الطبية والعديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية الأخرى مثل تحرير المحاصيل ، ومحركات الجينات (القدرة على تحفيز الوراثة المتحيزة لجينات معينة لتغيير مجموعة سكانية بأكملها) والتركيبات. علم الأحياء (التطبيقات غير الطبية لا تناقش هنا ، انظر [150] لمزيد من التفاصيل). على الرغم من الإمكانات الهائلة الكامنة في تقنية CRISPR-Cas9 ، يلزم إجراء مزيد من التحقيق لجعل النظام أداة قابلة للتطبيق وآمنة للنُهج العلاجية المفيدة. تشمل القضايا الصعبة التي لا تزال قائمة وتحتاج إلى معالجة في المستقبل الانقسام خارج الهدف بواسطة Cas9. تعد التأثيرات غير المستهدفة مصدر قلق كبير عند إعادة تشكيل المحتوى الجيني للخلايا حقيقية النواة بدقة. في بعض الحالات ، تم اكتشاف التغيرات الجينية في المواقع غير المستهدفة بترددات أعلى من الطفرة المرغوبة والتي تكشف بوضوح الحاجة إلى خصوصية أعلى للتقنية [151]. تشمل الاستراتيجيات التي تمنع التأثيرات غير المستهدفة حقن Cas9 المنقى مباشرة في الخلية بدلاً من التعبير عن البروتين المؤتلف في الخلية المستهدفة. هذه الطريقة مناسبة للانقسام السريع للهدف ولكنها تؤدي أيضًا إلى الاضمحلال السريع لـ Cas9 ، مما يقلل من احتمالية حدوث تأثيرات بعيدة عن الهدف [152،153]. علاوة على ذلك ، فإن استخدام اثنين من sgRNAs التي تستهدف كلا خيوط التسلسل المستهدف بالاشتراك مع متغير متماثل للحمض النووي من Cas9 أظهر أنه يقلل من التأثيرات غير المستهدفة بشكل ملحوظ [154]. تركز الاستراتيجيات الإضافية على تحسين تسلسل sgRNA من أجل تحقيق تحرير أكثر موثوقية. تم إظهار قطع sgRNAs بمقدار 2-3 نانومتر لتحسين خصوصية الهدف [155]. إضافةً إلى ذلك ، فإن إضافة اثنين من نيوكليوتيدات الغوانين في نهاية 5 ، بجوار المنطقة التكميلية المستهدفة من الدليل RNA ، يمكن أن تقلل من التأثيرات غير المستهدفة [156]. هناك مشكلة أخرى تتطلب مزيدًا من التحقيق وهي التسليم الكلي لنظام CRISPR-Cas9 إلى الخلايا المرغوبة لكائن متعدد الخلايا. واعد في الجسم الحي تتضمن المقاربات أنظمة ناقلات فيروسية وغير فيروسية تقدم Cas9 و sgRNA إلى الخلايا المرغوبة [110،157]. وعلاوة على ذلك، خارج الجسم الحي تعتمد المفاهيم على عزل الخلايا المشتقة من المريض والتي يتم زرعها مرة أخرى بعد التحرير الجيني. الميزة الرئيسية في استخدام هذا النهج هي تقييم التغيير الجيني الذي تم إدخاله. هنا ، يتم اختيار الخلايا التي تم تعديلها بشكل صحيح فقط بدون طفرات خبيثة خارج الهدف للزرع [110157]. على الرغم من استمرار بعض التحديات ، يبدو أنها مسألة وقت فقط حتى يصبح تحرير الجينوم المستند إلى CRISPR-Cas9 طريقة آمنة وقابلة للتطبيق تستخدم في مجموعة متنوعة من الأساليب العلاجية.


استنتاج

إن استخدام CRISPR-Cas9 للدراسات على مستوى الجينوم قد مكّن ووسع طبيعة وفائدة الشاشات الجينية لدى البشر لتصحيح الجينوم وتعديله بدقة ويمثل وسيلة محتملة لتصحيح الطفرات المسببة للأمراض [195]. على الرغم من أن نظام CRISPR-Cas9 لا يزال في مهده ، فقد أحدث ثورة في دراسات وظيفة الجينات ويحدث تأثيرًا كبيرًا على العلاج الجيني في صحة الإنسان. بالمقارنة مع تقنيات تعديل الجينات السابقة مثل RNAi ، فإن استخدام CRISPR-Cas9 أكثر كفاءة ونوعية للغاية. علاوة على ذلك ، أصبح نظام CRISPR-Cas9 أداة فعالة لتحرير الجينات قادرة على تصحيح الأمراض المرتبطة بالعمر عن طريق الجينات. حذف تكرار التوسعات سداسي النوكليوتيد في C9ORF72 الجين باستخدام نظام CRISPR-Cas9 أو تصحيح SOD1 أو فتحات الفتح قد تؤدي الطفرات الجينية إلى تحسين ALS و FTD غير المألوفين أو FALS على التوالي (الشكل 2). يمكن علاج مرض الزهايمر المبكر عن طريق تصحيح الطفرات في PSEN1, PSEN2، و تطبيق، والحد من توليد بيتا اميلويد. في حين يمكن استخدام تقنية CRISPR-Cas9 التي تستهدف الميتوكوندريا لعكس أو إزالة الطفرات التي تتراكم مع تقدم العمر. يمكن علاج شلل الرعاش الناجم عن الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا عن طريق استبدال الجينات الطافرة بالتسلسلات الأصلية وبالتالي منع تراكم البروتين السينيوكلين # x003b1 في أجسام ليوي وعصب ليوي ، أو الإفراط في التعبير عن العوامل التغذوية العصبية التي تسهل بقاء الخلايا العصبية ، أو تقليل التقلبات الحركية للمريض عن طريق توصيل AADC الجين في بوتامين مرضى PD. أيضًا ، قد يتم استهداف الخلايا السرطانية بواسطة نظام CRISPR-Cas9 ، مع الضربات القاضية لـ Par3L و Src-1 و GPRC6A لتحسين سرطان القولون والمستقيم والثدي والبروستاتا على التوالي ، مما يؤدي إلى زيادة الحساسية للعلاج الكيميائي ، وانخفاض الانتشار ، وزيادة موت الخلايا السرطانية . أثناء العدوى ، يعمل إفراز الإنترلوكين 1 بمثابة سيتوكين مؤيد للالتهابات في الأنسجة ، ويمنع تمايز الخلايا الجذعية ويعزز تدهور الأنسجة العدواني ، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة [196]. عند مستويات عالية من إفراز الجهاز المناعي للجزيئات الالتهابية ، يصبح من الضروري استهداف هذه الجزيئات. بالإضافة إلى استهداف IL-1 ، تتضمن إستراتيجية أخرى تصميم خلايا جذعية متعددة القدرات ومقاومة للالتهابات (iPSCs) عن طريق التخلص من مسار إشارات IL-1. في هذا السيناريو ، يلعب CRISPR-Cas9 دورًا واعدًا حيث تم استخدام هذا النظام على نطاق واسع لإنشاء خلايا حقيقية النواة مُهندَسة مع تغيرات في الوظيفة أو في اكتساب الوظيفة [9 ، 41]. تم إجراء دراسات مماثلة على خلايا الزرد وخطوط الخلايا السرطانية والخلايا التغصنية الأولية [34 ، 197]. لذلك ، يبدو دور تعديل CRISPR-Cas9 واعدًا في استهداف الالتهاب ، خاصةً في الأنسجة المريضة والتالفة.إن تقليل إنتاج السيتوكين المؤيد للالتهابات من خلال الضربة القاضية miR-155 يبشر بالخير كإستراتيجية علاجية لكل من التهاب المفاصل الروماتويدي والالتهاب. في حين أن خروج المغلوب من MUC18 ، في AECs ، قلل بشكل كبير من الالتهاب وقد يؤدي إلى تقليل التورم وانسداد الجهاز التنفسي. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية العلاجية بعيدة كل البعد عن الموافقة عليها سريريًا من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بسبب التحديات والقيود ذات الصلة (ملخصة في الجدول 1) ، مثل التأثيرات غير المستهدفة ، وكفاءة تعداء العدوى ، والعمر النصفي القصير [9-13 ، 15] . إذا تم تحقيق الاستخدام السريري ، فإن نظام تحرير الجينات CRISPR-Cas9 سيحسن من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة ، مما يؤثر على العديد من الأمراض ، ويقلل من عبء المرض ، والمراضة ، والوفيات.


شاهد الفيديو: احذر نقصه يخرب ضربات القلب يصلب الشرايين يرقق العظام يحطم الأعصاب يصيبك بالحزن والضعف والهلع (كانون الثاني 2022).