معلومة

ما هو الفرق بين الوحدة الفرعية ألفا والوحدة الفرعية غير ألفا في مستقبلات ACh؟


عند القراءة عن مستقبلات ACh ، غالبًا ما يتم وصف البروتين على أنه (alpha) أو (non-alpha). ومع ذلك ، لم أتمكن حقًا من معرفة معنى ذلك. ما هو الفرق ، ولماذا يكون مهمًا إذا كانت الوحدة الفرعية ألفا أم لا؟


مستقبلات Achetylcholine (ACh) هو خماسي من سلسلتين ألفا ، واحدة من سلاسل بيتا ، دلتا ، وجاما (في العضلات غير الناضجة) أو إبسيلون (في العضلات الناضجة).


مثل مستقبلات الغشاء الأخرى ، تُصنف مستقبلات الأسيتيل كولين وفقًا لـ "علم العقاقير" الخاصة بها ، أو وفقًا لتشابهاتها النسبية وحساسيتها للجزيئات المختلفة. على الرغم من أن جميع مستقبلات الأسيتيل كولين ، بحكم تعريفها ، تستجيب للأسيتيل كولين ، إلا أنها تستجيب أيضًا للجزيئات الأخرى.

    (NAChR، المعروفة أيضًا باسم مستقبلات الأسيتيل كولين "المؤيِّنة للتأين") تستجيب بشكل خاص للنيكوتين. مستقبل النيكوتين ACh هو أيضًا قناة أيون Na + و K + و Ca 2+. (mAChR، والمعروفة أيضًا باسم مستقبلات الأسيتيل كولين "الأيضية") تستجيب بشكل خاص للمسكارين.

النيكوتين والمسكارينيك نوعان رئيسيان من المستقبلات "الكولينية".

أظهرت البيولوجيا الجزيئية أن مستقبلات النيكوتين والمسكارين تنتمي إلى عائلات بروتينية متميزة. مستقبلات النيكوتين نوعان: Nm و Nn. يقع Nm [1] في الموصل العصبي العضلي الذي يسبب تقلص عضلات الهيكل العظمي عن طريق جهد الصفيحة الطرفية (EPPs). يسبب Nn إزالة الاستقطاب في العقد اللاإرادية مما يؤدي إلى اندفاع ما بعد العقدة. تتسبب مستقبلات النيكوتين في إطلاق الكاتيكولامين من النخاع الكظري ، وكذلك الإثارة أو تثبيط الموقع في الدماغ. كل من Nm و Nn مرتبطان بقناة Na + و Ca 2+ ولكن Nn مرتبط أيضًا بقناة K + إضافية.

تحرير nAChR

إن nAChRs عبارة عن قنوات أيونية ذات بوابات ترابطية ، وتتكون ، مثل الأعضاء الآخرين في عائلة القناة الأيونية ذات بوابات cys-loop ، من خمس وحدات فرعية بروتينية مرتبة بشكل متماثل مثل العصي حول البرميل. تكوين الوحدة الفرعية متغير للغاية عبر الأنسجة المختلفة. تحتوي كل وحدة فرعية على أربع مناطق تمتد على الغشاء وتتكون من حوالي 20 حمضًا أمينيًا. المنطقة الثانية هي الأقرب إلى تجويف المسام ، وتشكل بطانة المسام.

يؤدي ربط أستيل كولين إلى الطرف N لكل من وحدتي ألفا الفرعية إلى دوران 15 درجة لجميع حلزونات M2. [2] يحتوي جانب السيتوبلازم من مستقبلات NAChR على حلقات ذات شحنة سالبة عالية تحدد خصوصية الكاتيون المحددة للمستقبل وتزيل قشرة الماء التي تتكون غالبًا من الأيونات في محلول مائي. في المنطقة الوسيطة للمستقبل ، داخل تجويف المسام ، تحدد بقايا فالين والليوسين (Val 255 و Leu 251) منطقة كارهة للماء يجب أن يمر خلالها الأيونات المجففة. [3]

تم العثور على nAChR عند حواف الطيات الوصلية عند التقاطع العصبي العضلي على الجانب بعد المشبكي ، يتم تنشيطه عن طريق إطلاق أستيل كولين عبر المشبك. يؤدي انتشار Na + و K + عبر المستقبل إلى إزالة الاستقطاب ، وهي إمكانات اللوحة النهائية ، التي تفتح قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربائي ، مما يسمح بإطلاق جهد الفعل والتقلص العضلي المحتمل.

تحرير mAChR

في المقابل ، فإن mAChRs ليست قنوات أيونية ، ولكنها تنتمي بدلاً من ذلك إلى عائلة فائقة من المستقبلات المقترنة ببروتين G التي تنشط القنوات الأيونية الأخرى عبر سلسلة مراسلة ثانية. ينشط المستقبل الكوليني المسكاريني بروتين G عندما يرتبط بـ ACh خارج الخلية. تنشط الوحدة الفرعية ألفا لبروتين G محلقة الجوانيلات (تثبط تأثيرات cAMP داخل الخلايا) بينما تنشط الوحدة الفرعية بيتا جاما القنوات K وبالتالي تزيد من استقطاب الخلية. هذا يسبب انخفاض في نشاط القلب.

يمكن تصنيف مُعدِّلات مستقبلات الأسيتيل كولين من خلال الأنواع الفرعية للمستقبلات التي تعمل على:

ACh ومستقبلاته
المخدرات نانومتر ن م 1 م 2 م 3
ACh ، Carbachol ، Methacholine ، AChEi (Physostigmine ، Galantamine ، Neostigmine ، Pyridostigmine) + + + + +
النيكوتين والفارينكلين + +
سكسينيل كولين +/-
أتراكوريوم ، فيكورونيوم ، توبوكورارين ، بانكورونيوم -
إبيباتيدين ، DMPP +
تريميثافان ، ميكاميلامين ، بوبروبيون ، ديكستروميثوفان ، هيكساميثونيوم -
المسكارين ، أوكسوتريمورين ، بيثانيكول ، بيلوكاربين + + +
أتروبين ، تولترودين ، أوكسيبوتينين - - -
Vedaclidine ، Talsaclidine ، Xanomeline ، Ipatropium +
Pirenzepine ، Telenzepine -
ميثوكترامين -
Darifenacin ، 4-DAMP ، Darifenacin ، Solifenacin -

يمكن حظر مستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتين عن طريق curare و hexamethonium والسموم الموجودة في سموم الثعابين والمحار ، مثل α-bungarotoxin. ترتبط الأدوية مثل عوامل الحجب العصبي العضلي بشكل عكسي بمستقبلات النيكوتين في الوصل العصبي العضلي وتستخدم بشكل روتيني في التخدير.

مستقبلات النيكوتين هي الوسيط الأساسي لتأثيرات النيكوتين. في الوهن العضلي الوبيل ، يتم استهداف المستقبل في الموصل العصبي العضلي بواسطة الأجسام المضادة ، مما يؤدي إلى ضعف العضلات. يمكن حظر مستقبلات الأسيتيل كولين المسكارينية بواسطة أدوية الأتروبين والسكوبولامين.

متلازمة الوهن العضلي الخلقي (CMS) هي اضطراب عصبي عضلي وراثي ناتج عن عيوب من عدة أنواع في الموصل العصبي العضلي. عيوب ما بعد المشبكي هي السبب الأكثر شيوعًا لـ CMS وغالبًا ما تؤدي إلى تشوهات في مستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتين. تم العثور على غالبية الطفرات التي تسبب CMS في جينات الوحدات الفرعية AChR. [4]

من بين جميع الطفرات المرتبطة بـ CMS ، فإن أكثر من نصفها عبارة عن طفرات في أحد الجينات الأربعة التي تشفر الوحدات الفرعية لمستقبلات الأسيتيل كولين البالغة. غالبًا ما تؤدي طفرات AChR إلى نقص في الصفيحة النهائية. معظم طفرات AChR هي طفرات في جين CHRNE. رموز الجينات CHRNE للوحدة الفرعية إبسيلون من AChR. معظم الطفرات هي طفرات وراثية متنحية لفقدان الوظيفة ونتيجة لذلك هناك صفيحة نهائية نقص AChR. يرتبط CHRNE بتغيير الخصائص الحركية لـ AChR. [5] نوع واحد من الطفرات للوحدة الفرعية إبسيلون من AChR يقدم Arg في موقع الربط في واجهة الوحدة الفرعية α / للمستقبل. إن إضافة Arg الكاتيوني إلى البيئة الأنيونية لموقع ربط AChR يقلل بشكل كبير من الخصائص الحركية للمستقبل. نتيجة ARG التي تم تقديمها حديثًا هي تقليل تقارب ناهض بمقدار 30 ضعفًا ، وتقليل كفاءة البوابة بمقدار 75 ضعفًا ، واحتمال فتح قناة ضعيف للغاية. ينتج عن هذا النوع من الطفرات شكل قاتل للغاية من CMS. [6]


Alpha 5 و alpha 3 و non-alpha 3. ثلاث جينات متجمعة من الطيور تشفر الوحدات الفرعية ذات الصلة بمستقبلات النيكوتين الأسيتيل كولين.

في الفقاريات ، تتجمع مستقبلات الأسيتيل كولين العصبية النيكوتين (nAChRs) في قياس كيميائي غير معروف من وحدتين فرعيتين متماثلتين ، ألفا وغير ألفا. ما هو حجم ذخيرة هذه الوحدات الفرعية وكم عدد الأنواع الفرعية من NAChRs المختلفة وظيفيًا التي يمكن أن تشكل؟ وجدنا في جينوم الطيور مجموعة من ثلاثة جينات مرتبطة ارتباطًا وثيقًا تمتد على 28 زوجًا من الكيلوبات وتشفر ثلاثة بروتينات ، n alpha 3 و alpha 3 و alpha 5 ، التي لها السمات المتوقعة للوحدات الفرعية nAChR العصبية. يقع Gene n alpha 3 على 5 بوصات من alpha 3 (تم تحديد دوره في الكولينو بالفعل) ويتم نسخه من نفس خيط DNA ، بينما يقع alpha 5 على 3 'من alpha 3 ويتم نسخه من خيط DNA المعاكس. تتكون بنية جينات n alpha 3 و alpha 5 من ستة exons مع مواقع لصق محفوظة بدقة وهي مطابقة لبنية جينات الوحدة الفرعية لمستقبلات الطيور العصبية المميزة سابقًا alpha 2 و alpha 3 و alpha 4 و n alpha 1. alpha تعد نسخ 3 و n alpha 3 و alpha 5 نادرة في الجهاز العصبي المركزي ، ولكن يمكن اكتشاف alpha 3 و n alpha 3 بسهولة في العقد الجنينية العنقية والعقد الهدبية العلوية. من أجل فحص الوظيفة ، تم استنساخ الجين المشفر n alpha 3 و cDNAs المشفر alpha 3 و alpha 4 و alpha 5 و n alpha 1 في ناقل تعبير ، وتم حقن البنى في نوى Xenopus oocyte ، إما بشكل فردي أو في مجموعات زوجية من ألفا وأخرى ليست ألفا. بعد يوم إلى خمسة أيام ، تم فحص حساسية ACh للبويضات المحقونة في مشبك الجهد. أثار الجين n alpha 3 و n alpha 1 cDNA تجميع nAChRs عند حقنه باستخدام alpha 3 أو alpha 4 cDNA وكانت الخصائص الكهربية للتركيبات الزوجية الأربعة مختلفة بشكل كبير. ومع ذلك ، فإن alpha 5 لم توجه تجميع nAChRs الوظيفية عند حقنها بمفردها أو بالاشتراك مع n alpha 1 أو n alpha 3.


ما هو الفرق بين الوحدة الفرعية ألفا والوحدة الفرعية غير ألفا في مستقبلات ACh؟ - مادة الاحياء

البيولوجيا العصبية I (W3004) أسئلة انتقال متشابك وجواب المفتاح

1. (4 نقاط مئوية) ما هي المعايير الأربعة لتحديد مادة ما كناقل عصبي؟

توليفها في العصبونات

موجود في محطة ما قبل الجراحة وتم إصداره بكميات كافية لانتخاب استجابة متوقعة

تطبيق خارجي يحاكي عمل أجهزة الإرسال المحددة داخليًا أو آليات الإزالة

2. (2 نقطة) تُعرف البروتينات التي تتوسط في الانتقال المشبكي من خلال تقاطعات الفجوة في المشابك الكهربائية باسم الروابط . ستة من هذه الوحدات البروتينية تشكل أ كونيكسون . عندما يتطابق اثنان من هذه البروتينات ، أحدهما على الغشاء السابق والآخر على الغشاء اللاحق للتشابك ، فإن القناة الناتجة تسمى مفرق الفجوة.

3- (10 نقاط) بعض أرقام المقياس:

أ. سعة إمكانات لوحة النهاية المصغرة (MEPP) بالسيارات.

ب. كثافة مستقبلات ACh (لكل um2 عند قمم NMJ)

ج. عدد جزيئات ACh في الحويصلة المشبكية

د. التركيز داخل الخلايا (M) من أيونات Ca ++ الحرة

ه. عرض الشق المشبكي عند NMJ ، نانومتر

F. قناة توصيل أحادية القناة لمستقبلات ACh ، عند الفتح ، في pS.

ز. إمكانية عكس تيار اللوحة النهائية ، بالسيارات.

ح. عدد الوحدات الفرعية التي تشكل قناة تنشيط ACh.

أنا. عدد مواقع ربط ACh على قناة مستقبلات ACh

ي. عدد أنواع الوحدات الفرعية المساهمة في قناة مستقبلات ACh

ك. عدد مناطق الغشاء الممتدة في كل وحدة فرعية من

4. (5 نقاط) يتم تطبيق ACh باستخدام ماصة الرحلان الشاردي مباشرة على تقاطع عصبي عضلي.

أ) ما هي الاستجابة التي تتوقعها في الخلية اللاحقة للتشابك؟ (ارسم تيار آخر متشابك)

كان هناك حاجة إلى رسم بسيط EPSP. لا يمكن الافتراض أن هناك ما يكفي لإحداث إجراء محتمل ، ولكن إذا تم رسم كلاهما ، فسيكون الأمر على ما يرام. يتم قبول الفولتية والمسارات الحالية.

ب) ما هو تأثير الأدوية التالية على هذه الاستجابة (ارسم واشرح).

(كتل TTX قنوات الصوديوم المعتمدة على الجهد الكهربائي ، تذكر؟) لن يتم إنشاء أي إمكانات عمل ولكن ببساطة EPP.

CURARE يربط بشكل غير طبيعي مع أجهزة استقبال ACH ذات الصلة العالية للغاية. لذلك ، لن يكون هناك استجابة ما بعد الحادثة. رسم PSP سيكون خطًا ثابتًا - لا شيء يحدث.

كتل البروستيجمين إستيراز الأسيتيل كولين ، مما يزيد من تركيز ACH في المحلول لفترة زمنية أطول. سيكون التأثير هو إطالة وزيادة اتساع PSP ، لذا يجب أن يكون الرسم استجابة أطول وأكبر. سيتم إزالة ACH فقط من خلال DIFFUSSION.

(كتل الشاي قنوات البوتاسيوم.) بافتراض أنه تم تطبيق ما يكفي من ACh من أجل الحصول على AP ، فإن AP سوف تتبع دورة Na الحالية. إذا لم تكن ACh كافية لانتخاب AP فلن يكون هناك أي تأثير في الاستجابة.

5. (4 نقاط مئوية) يتم التوسط في الانتقال عند المشبك الآخر عن طريق مسار cAMP المرسل الثاني ويتضمن بروتين G. عند التحفيز مع المناسب

يتم إنتاج EPSP بطيء في خلية ما بعد التشابك. ماذا سيكون تأثير إضافة المواد التالية إلى خلية ما بعد المشبكي:

أ- IBMX ، دواء يثبط PDE.

ب- ذيفان الكوليرا ، وهي مادة يمكنها ADP- ريبوسيلات Gs وتثبط نشاط GTPase.

لا يزال G-ALPHA مرتبطًا بـ GTP.

ج- GTP g s ، شكل من أشكال GTP لا يمكن تحللها بالماء.

في جميع الحالات الثلاث ، سيكون هناك زيادة في الاستجابة (استجابة أطول بتوسيع أكبر).

د- إضافة مبالغ زائدة من الوحدة الفرعية التنظيمية لـ PKA.

سوف تمنع PKA-R الخارجية PKA-C ، وبالتالي ستحدث الفسفرة الأقل ، مما يؤدي إلى اتساع أصغر للاستجابة.

7. (12 نقطة) أ) ينتج عن تحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكية GABAergic IPSP ، والذي يتأخر بمقدار

20 مللي ثانية ، لا يتأثر بالباربيتورات ، ويمكن حظره بواسطة TEA. وصف مسار تحويل الإشارة المحتمل (من مستقبل إلى قناة).

الجواب: تتم هذه الاستجابة بوساطة مستقبلات GABA الأيضية. جاباب المستقبلات والتنشيط المسجل لبروتينات G و reg مع أو بدون مراسلات ثانية (عن طريق الربط المباشر لوحدة G beta-gamma الفرعية) وفتح reg لقنوات K + و reg IPSP.

ب) في تجربة أخرى ، ينتج عن تحفيز الخلايا العصبية الكولينية قبل المشبكية EPSP ، والذي يتأخر بمقدار

50 مللي ثانية ، لم يتم حظره بواسطة curare ولكن تم حظره بواسطة TEA. وصف مسار تحويل الإشارة المحتمل (مرة أخرى من مستقبل إلى قناة) واشرح كيفية إنتاج EPSP.

الجواب: تتم هذه الاستجابة بوساطة مستقبلات ACh الأيضية. مستقبلات mACh وتفعيل تسجيل البروتينات G وتفعيل التسجيل لـ PLC وتسجيل الانهيار لـ PIP2 وتثبيط ريج لقنوات K + النشطة.

يحافظ الفتح المستمر لقنوات K + على إمكانات الغشاء بالقرب من E.ك. ولكن بالإضافة إلى قنوات K + ، هناك أيضًا قنوات تسرب مفتوحة باستمرار ، والتي لها إمكانية انعكاس بالقرب من 0 مللي فولت. عندما يتم تثبيط قنوات K + ، يوجد تيار داخلي صافٍ يتدفق عبر قنوات التسرب ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب من الغشاء وينتج EPSP.

8. (5 PTS) حدد المرسل المحتمل

أ. في مشابك خلية أدرينالية.

ب . عند المشبك لخلية موجبة للتيروزين هيدروكسيلاز

ج. في المشبك الذي يحتوي على الكولين

د . في المشبك حيث يمكن محاكاة الفعل بواسطة kainate

ه. في المشبك الذي يستجيب مع IPSP بسبب زيادة تصرف Cl متشابك بعد

9. (2 نقطة مئوية) ينشأ التنوع الوظيفي بين البروتينات G بشكل أساسي من الاختلافات في الوحدة الفرعية ألفا أو بيتا أو جاما؟

10. (4 PTS) حدد خطوتين في مسار cAMP وخطوتين في مسار IP3 حيث يوجد تضخيم للإشارة.

cAMP: يمكن للمستقبل المفرد المرتبط أن ينشط العديد من بروتينات G ، ويمكن أن يحفز Adenyl cyclase إنتاج العديد من جزيئات cAMP ، ويمكن لـ cAMP واحد تنشيط العديد من جزيئات PKA ، ويمكن لجزيء PKA واحد أن يفسف العديد من البروتينات المستهدفة.

IP3: يمكن للمستقبل المفرد تنشيط العديد من بروتينات G ، ويمكن لـ PLC توليد العديد من جزيئات IP3 ، ويمكن لـ PKC أن يفسف العديد من البروتينات المستهدفة ، ويمكن لـ IP3 إطلاق العديد من أيونات Ca ++ ، ويمكن لـ Ca ++ / DAG تنشيط PKC.

(ملاحظة: وصف المسار بأكمله ليس هو الإجابة الصحيحة.)

11. (4 نقاط) ارسم منحنى I-V لقناة NMDA في وجود وغياب Mg ++. قم بتسمية كل منحنى بوضوح وحدد منطقة اعتماد الجهد على الرسوم البيانية.

ما تحتاج إلى توضيحه هو أن القناة محجوبة بواسطة Mg ++ عند فولتات أقل من -40mV. الإمكانات العكسية هي 0. مجال الاعتماد على الجهد الكهربائي هو في الإمكانات السلبية في وجود Mg ++. في حالة عدم وجود Mg ++ في عدم اعتماد الجهد.

12. (4 PTS) صمم تجربة للحصول على قيمة التيار بسبب مستقبل NMDA في خلية محفزة بالغلوتامات تحتوي على كل من AMPA و

قم بقياس التيار (تحت الجهد الكهربائي) باستخدام محلول الحمام الطبيعي ثم قم بإغلاق كل نوع من أنواع المستلمين بشكل انتقائي. إذا قمت بحظر مستقبلات AMPA باستخدام CNQX ، فإن الإجراء الحالي الذي تقيسه يرجع فقط إلى NMDA Rs. إذا تم حظر NMDA Rs باستخدام APV ، فعندئذٍ & quotN MDA CURRENT & quot = & quotCONTROL CURRENT & quot - & quotAMPA CURRENT & quot.

13. (4 نقاط مئوية) وصف الفرق بين مستقبلات مؤثرات الأيض ومستقبلات التمثيل الغذائي مع إعطاء مثال لكل منهما.

المستقبِلات الأيونية من القنوات الأيونية نفسها (من هنا المصطلح البديل & مثل القنوات الأيونية ذات البوابات LIGAND & quot) ، حيث تؤثر المستقبِلات الأيونية على القنوات الأيونية بشكل غير مباشر ، عبر تنشيط G-PROTEINS.

أمثلة على المستقبلات IONOTROPIC: النيكوتينيك ACh-Rs ، Glu-Rs (NMDA ، AMPA / KAINATE) ، GABA-R ، GLYCINE-R.

أمثلة على METABOTROPIC Rs: MUSCARINIC ACh-Rs ، BETA-ADRENERGIC- Rs ، HISTAMINE- Rs ، DOPAMINE- Rs.

14. (4 نقاط) ما هي العيوب الأخرى (غير المتعلقة بالذاكرة) التي يمكن أن تؤدي إلى ضعف الأداء في اختبار متاهة موريس المائية؟ قم بتسمية اثنين على الأقل ، وما هي الاختبارات التي يمكنك القيام بها

استخدم للقضاء على هذه الاحتمالات.

ضعف (مشاكل) المحرك ، مشاكل في الرؤية.

15. (3 نقاط مئوية) في خلية الراحة ، يكون تركيز Ca2 + حوالي 0.1 ميكرومتر ، ما هو تركيز Ca2 بالقرب من قنوات Ca2 + المفتوحة أثناء جهاز الإرسال

عدة مئات من الميكرومولار ، 200-300 ميكرومتر.

16. (4 نقاط مئوية) بناءً على الشكلين 1 أ و 1 ب من Nowak et al. (الطبيعة ، 1984 ، 307: 462-465):

لماذا يرون تأثيرًا في الإمكانات السلبية فقط؟

(راجع أيضًا السؤال رقم 11) في الإمكانات السلبية ، تم حظر القناة بواسطة Mg ++.

ماذا يخبرك شكل منحنى 500um Mg ++ I / V عن تنشيط هذه القناة؟

في الإمكانات غير المستقطبة نسبيًا ، على وجه التحديد & gt & raquo -40mV ، تم تجاوز Mg ++. القناة تعتمد على الجهد الكهربائي في هذه المنطقة.

ما الأدلة التي تشير إلى أنها قناة كاتيون غير انتقائية؟

الإمكانات العكسية = 0 ، يمر الانحناء I-V من خلال (0 ، 0).

ما الذي يبحثون عنه في تحليل الضوضاء؟ ماذا يخبرهم هذا؟

ما يبحثون عنه في الواقع في تحليل الضوضاء هو فتح وإغلاق القنوات. هذا يمنحهم وقتًا مفتوحًا للقناة.

17. (5 نقاط) يقترح ، في جملة أو جملتين ، آلية جزيئية واحدة لتحويل الذاكرة قصيرة المدى إلى ذاكرة طويلة المدى.

الأنماط الدستورية النشطة

تنشيط مستقبل NMDA و LTP

18. (2 نقطة) في جملة واحدة ، ما هو التكييف الكلاسيكي؟

تعلم مساعد بين الولايات المتحدة و CS.

19. (النقاط الثلاث) صف الفرق بين التعلم النقابي وغير النقابي وقدم مثالاً لكل منهما.

الاختلاف: صريح (على سبيل المثال ، حقائق تذكر) مقابل الذاكرة الضمنية (على سبيل المثال ركوب الدراجة).

التعلم المساعد: PAVLOV'S DOG EXP ، CLASSICAL CONDITIONING

التعلم غير التعاوني: التحسس والتأقلم

20. (3 نقاط) في ساندو وآخرون. ورقة عن السلوكيات بوساطة 5-HT1B

المستقبل ، يصف المؤلفون دور مستقبلات 5-HT1B في الحركة والعدوانية. ما هو النموذج / النظام التجريبي الذي استخدموه في دراستهم؟

الفئران التي تفتقر إلى جهاز الاستقبال 5-HT1B (5-HT1B KNOCKOUTS).

21. (2 نقطة) انتقال متشابك كهربائي

22- (4 نقاط) صف بنية بروتين كيناز أ وكيف يمكن أن يساهم هذا الهيكل في التحسس طويل الأمد.

يتكون PKA من وحدتين فرعيتين تنظيميتين متماثلتين متصلتين ببعضهما البعض عبر سندات نزع الكبريت و 2 وحدة فرعية محفزة. تحتوي كل وحدة فرعية تنظيمية على موقعين ملزمين للمخيم. يعتبر PKA خطوة البدء في آلية التحسس طويل المدى: عندما يربط المخيم بالوحدات الفرعية التنظيمية ، يتم إطلاق الوحدات الفرعية المحفزة وترجمتها في النواة حيث يتم إنشاء الفوسفور. بسبب تخليق البروتين ، الذي يشارك في التحسس طويل الأمد ، تم تحفيزي.

23- (ثلاث نقاط) ما هو العقورين؟ صف بإيجاز تجربة يمكنك فيها استخدام aeqorin لإظهار أن الأيون المحدد الذي يرتبط به مرتبط بإطلاق ناقل عصبي في مشابك الحبار العملاق؟

AEQORIN هو بروتين ضوئي منخفض الحساسية يعتمد على الكالسيوم ، والذي يعني (باللغة الإنجليزية) أنه بروتين

ينبعث الضوء (الأزهار) في وجود Ca ++ المجانية. لذلك يمكن استخدامه كجهاز كشف مباشر ومثل لـ Ca ++.

يتم وصف استخدام AEQORIN للكشف عن مجالات تركيز عالية من الكالسيوم في SYNAPSE الحبار العملاق في LLINAS وآخرون. ورق. يتم حقن AEQORIN مبدئيًا في محطة ما قبل الحمل من شراب الحبار العملاق. بواسطة EPIFLUORESCENCE MI CROSCOPY ، يمكنك تصوير المحطة. إذا قمت بتحفيز ألياف ما قبل الحمل ، فسترى بقعًا بيضاء تتوافق مع نطاقات الانبعاث الكمي. إذا قمت بفرض صورتين متدفقتين (أي قبل التحفيز وبعده) ، فسترى أن QEDs تتطابق مع المحطة الطرفية PRESYNAPTIC ، مما يعني أن قنوات Ca ++ مفتوحة ويتم إصدار Ca ++ SYNA في الجزء من ذلك. وسائل التحفيز

إطلاق جهاز نقل الأعصاب ، لذلك يجب أن يكون مرتبطًا بالزيادة الملحوظة في مستويات الكالسيوم.


السموم العصبية α- التي تستهدف nAChR

إن السموم الخيطية α التي تستهدف nAChRs العصبية عديدة ولديها انتقائية أكثر دقة للأنواع الفرعية ، وربما يرجع ذلك إلى التنوع الكبير في الأشكال الإسوية في هذه الفئة الفرعية من المستقبلات. يتم سرد أعضاء هذه العائلة من السموم التي تم اكتشافها حتى الآن أدناه ، بدون ترتيب معين (انظر أيضًا الجدولين 2 و 3).

ألفا كونوتوكسين ImI و ImII

كان أول α-conotoxin الذي يستهدف nAChRs العصبية هو α-CTx ImI. كان أيضًا أول سم كونوتوكسين ألفا يتم عزله من سم أحد أنواع صيد الديدان ، كونوس إمبرياليس 38. يحتوي α-conotoxin هذا على تباعد حلقة غير عادية بين السيستين 4/3 (الشكل 1A). تم العثور على هذا الببتيد ليكون غير نشط عند حقنه بين الصفاق ، في حين تسبب الحقن داخل البربر في حدوث نوبات وموت 38. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع هذا السم استجابات النيكوتين للخلايا البائية على العقد الودية للضفدع ولكن ليس للثدييات العصبية العضلية 38 ، 39. أظهر التوصيف الدوائي اللاحق على NAChRs المعبر عنه بشكل متغاير IC50 من 220 نانومول / لتر على α7 nAChRs متماثل و 1.8 ميكرول / لتر على α9 nAChRs متماثل 16. إليسون وآخرون، (2004) أبلغت عن IC50 من 595 نانومول / لتر على α7 nAChR متماثل ، لكنهم أظهروا أيضًا تثبيطًا قويًا لـ α3β2 nAChR غير المتجانس (IC50 41 نانومول / لتر). يُفترض أن التأثيرات المسببة لنوبة هذا السم ترجع إلى تثبيطه من α7 nAChRs الحساسة لسموم α-bungarotoxin على الخلايا العصبية الحصينية 40. اقترحت دراسات النشاط البنيوي دورًا للمخلفات في الحلقة الأولى من السم ، Asp5 ، Pro6 ، و Arg7 ، بالإضافة إلى Trp10 في الحلقة الثانية ، في التفاعل مع الوحدة الفرعية α7 41. نمذجة التنادد باستخدام أبليسيا يؤكد AChBP ، وهو متماثل هيكلي لمنطقة ربط N-terminal الخاصة بـ nAChRs ، دورًا رئيسيًا لـ Arg7 و Trp10 في التفاعل مع المخلفات في موقع ربط ligand 42 ، 43. التبلور المشترك لـ α-CTx ImI مع أبليسيا يكشف AChBP عن حلقة C أكثر انفتاحًا لاستيعاب α-conotoxin 44. تم أيضًا تحديد بقايا الوحدة الفرعية α7 التي تتفاعل مع السم.

في السنوات الأخيرة ، بذلت محاولات لتحسين الاستقرار البيولوجي لسموم ألفا من خلال حماية روابط ثاني كبريتيد ضد الاختزال أو التدافع بسبب التعرض للبيئات داخل أو خارج الخلية ، مثل الدم. استخدمت إحدى هذه الدراسات سيلينوسيستين بدلاً من السيستين لإنتاج العديد من نظائر السلينوكونوتوكسين لـ α-CTx ImI 47. على الرغم من أنه يشبه wildtype α-CTx ImI في كل من البنية والنشاط ضد α7 nAChRs ، إلا أن نظائر السيلنوكونوتوكسين كانت أكثر استقرارًا من wildtype α-CTx ImI في ظل مجموعة متنوعة من ظروف الاختزال الكيميائية والبيولوجية. الطريقة الثانية لتحسين الاستقرار التوافقي هي استبدال جسور السيستين بروابط ديكربا غير قابلة للاختزال. كان للتناظرية dicarba لـ α-CTx ImI بنية مشابهة للنوع البري α-CTx ImI ، مع اختلاف طفيف في هندسة ثاني كبريتيد ضد جسور ديكربا. كان نشاط التناظرية ضد α7 nAChR مشابهًا للنوع البري α-CTx ImI 48.

سم مخروطي آخر α4 / 3 من سم كونوس إمبرياليس، α-CTx ImII ، باستخدام استراتيجية اكتشاف قائمة على PCR 49. على الرغم من أنه متماثل للغاية مع α-CTx ImI في تسلسل (9 من أصل 12 من الوحدات البنائية) ، فإن α-CTx ImII ، على عكس α-CTx ImI ، لا يتنافس مع α-bungarotoxin للارتباط بـ α7 nAChRs المعبر عنه بشكل غير متجانس ، مما يشير إلى وجود متميز و ربما موقع ربط جديد على α7 nAChR لـ α-CTx ImII 50. يرجع الاختلاف في ارتباط السمين إلى وجود Pro في الموضع 6 من α-CTx ImI ، والذي ثبت أنه مهم لتفاعل هذا السم مع α7 nAChRs 41. يحتوي α-CTx ImII على Arg في هذا الموضع ، يؤدي حدوث طفرة من Arg إلى Pro إلى إنشاء نظير يتنافس مع ربط α-bungarotoxin 49.

Α-Conotoxins MII ، PIA ، OmIA

تم عزل سم α- كونوتوكسين ثانٍ من كونوس ماجوس كان α-CTx MII. إنه ينتمي إلى عائلة α4 / 7 الفرعية (الشكل 1). تحجب α-CTx MII النوع الفرعي α3β2 nAChR بقوة 2-4 مرات من الحجم أعلى من معظم مستقبلات النيكوتين الأخرى ، بما في ذلك النوع الفرعي للعضلات 51. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الملزمة على الحيوانات التي تم إخراجها من الخسارة 52 وكذلك الدراسات الوظيفية 53 ، أن α-CTx MII يعمل أيضًا بشكل فعال في nAChRs المحتوية على α6. بعد ذلك ، تم عمل سلسلة من نظائر α-CTx MII التي تستهدف بشكل انتقائي الكايمري α6 / α3β2β3 54 ضد α3β2 nAChR 53. هذه النظائر السامة هي أكثر مضادات α6 * nAChR انتقائية تم الإبلاغ عنها حتى الآن. تم استخدام wildtype α-CTx MII ، بالإضافة إلى عدد من α6 * (تشير العلامة النجمية إلى وجود وحدات فرعية إضافية) نظائر α-CTx MII الانتقائية ، لتوصيف الأنواع الفرعية لـ nAChR التي تعدل إطلاق الدوبامين في الفئران 55 ، 56 ، 57 ، 58 ، 59 ، 60 ، 61 ، الفئران 62 ، 63 ، 64 ، 65 ، والقرد المخطط 66 ، 67. تشير هذه الدراسات إلى دور α6β2 * و α6α4β2 * nAChRs في تعديل إطلاق الدوبامين في المخطط والنواة المتكئة. تم تأكيد مساهمة كل من الوحدتين الفرعيتين α4 و 3 في مواقع ربط α-CTx MII في الخلايا العصبية الدوبامينية في الدراسات التي أجريت باستخدام الفئران المتعثرة 64 ، 68 ، 69. تشير بعض الدراسات أيضًا إلى تقليل التنظيم الانتقائي لـ α6 * nAChRs عند التعرض المزمن للنيكوتين 70 ، 71. تم استخدام α-CTx MII أيضًا لتوصيف nAChRs المتميزة التي تعدل [3 H] إطلاق NE في الفئران 72 ضد 73. يلخص الجدول 4 بعض الوظائف الفسيولوجية بوساطة NAChR التي تتميز باستخدام السموم α.

حددت دراسات الهيكل والنشاط بقايا الأحماض الأمينية في الوحدات الفرعية α3 و β2 nAChR التي تتفاعل مع α-CTx MII. وتشمل هذه Lys185 و Ile188 على الوحدة الفرعية α3 و Thr59 و Val109 و Phe117 و Leu119 على الوحدة الفرعية β2 74 ، 75. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام α-CTx MII [S4A E11A L15A] لتحديد بقايا الأحماض الأمينية للوحدة الفرعية nAChR التي تتفاعل مع وتمنح انتقائية لـ α6 ضد الوحدة الفرعية α3 76. والجدير بالذكر أن بقايا الوحدة الفرعية nAChR تختلف عن تلك التي تتفاعل مع wildtype α-CTx MII 74.

سمح الوسم الإشعاعي لـ α-CTx MII بالقياس المباشر لمواقع الربط لهذا السموم ألفا داخل الدماغ 77. تم مؤخرًا تصنيع نظائر α-CTx MII ذات العلامات الفلورية. باستخدام α-CTx MII ، وجد Quik وزملاؤه تنظيمًا انتقائيًا لربط مواقع ربط α-CTx MII داخل مخطط القوارض والقرد بعد تلف نيغورستريتات 79 ، 80 ، 81 ، 82 وكذلك في البشر المصابين بمرض باركنسون 82. يُظهر القياس المباشر لمواقع α-CTx MII أيضًا الاسترداد التفضيلي لهذه المواقع في القرود المسموح لها بالتعافي من الضرر الأسود للولادة. أظهرت الدراسات الملزمة باستخدام نظير α-CTx MII ، α-CTx MII [E11A] ، فقدًا انتقائيًا لنوع فرعي معين من nAChR (α6α4β2 *) في نماذج القوارض والقرود لمرض باركنسون. تم تكرار هذه الدراسات في أنسجة ما بعد الوفاة من البشر المصابين بمرض باركنسون 83. وبالتالي ، فإن هذا التناظرية α-CTx MII يحتوي على انتقائية من النوع الفرعي لـ nAChR التي لها إمكانية في التشخيص المبكر لمرض باركنسون.

تم إجراء عدد من المحاولات لتعزيز استقرار α-CTx MII ضد تحلل البروتين وكذلك لتحسين قابليته للدهون ، بهدف زيادة التوافر الحيوي عن طريق الفم لهذا السم. أدى تدوير العمود الفقري عن طريق استخدام موضع الرابط والانضمام إلى طرفي N و C إلى العديد من نظائر α-CTx MII الحلقية. كان اثنان من هذه النظائر لهما هياكل مشابهة لتلك الأصلية α-CTx MII ، على الرغم من أن واحدًا فقط من هذه النظائر - الذي يحتوي على أطول نشاط محتفظ به بالرابط مشابه لـ α-CTx MII الأصلي. كان التناظرية الدورية أكثر استقرارًا من السم الأصلي في البلازما البشرية 84. لتعزيز محبة الدهون في α-CTx MII ، تم اقتران السم مع 2-amino-د,إل- حمض الدوديكانويك (Laa) عند الطرف N. كان لهذا التناظرية α-CTx MII المترافق نهائيًا بنية ونشاطًا مشابهًا مقارنة بالببتيد الأصلي 85 ، لكنه أظهر نفاذية محسّنة بشكل ملحوظ عبر الطبقات الأحادية الخلية Caco-2 85. على الرغم من أن النظير المترافق Laa لم يعبر حاجز الدم في الدماغ إلى حد كبير ، إلا أن امتصاصه من خلال الجهاز الهضمي بعد تناوله عن طريق الفم كان أكبر من الأم α-CTx MII 86.

عدد من السموم الأخرى ألفا ذات انتقائية إما تجاه α3β2 أو α6β2β3 nAChRs. α-CTx PIA ، تم اكتشافه من خلال استنساخ cDNA المستند إلى PCR من قناة السم من كونوس بوربوراسينس، يحتوي على IC سفلي بحوالي 70 ضعفًا50 للخيال α6 / α3β2β3 ضد α3β2 nAChRs 87. في المقابل ، α-CTx OmIA ، منقى من سم كونوس أوماريا، لديه انتقائية تفضيلية (20 ضعفًا) لـ α3β2 ضد α6 / α3b2b3 nAChRs 88 ، 89. وهو أيضًا مثبط قوي لـ α7 nAChR 89.

Α-Conotoxins GIC و GID

تمت تنقية سمين ألفا كونوتوكسين خاصين بـ nAChRs العصبية من سم كونوس الجغرافي. α-CTx GIC ، وهو ذيفان α4 / 7 تم تحديده من الحمض النووي الجيني لـ كونوس الجغرافي، لديها فعالية نانومولار منخفضة لـ α3β2 و α6β2 nAChRs ضد العضلات ، α3β4 و α4β2 nAChRs 90 ، 91. α-CTx GID ، على الرغم من تشابهه مع α-CTx GIC في تباعد حلقة السيستين (α4 / 7) ، يختلف هيكليًا عن α-CTx GIC و nAChR العصبية الأخرى المستهدفة α-conotoxins بعدة طرق. أولاً ، يحتوي على مخلفات N-terminal إضافية مقارنة بـ α-CTx GIC ومعظم السموم الأخرى التي تم تحديدها مسبقًا. ثانيًا ، يحتوي على تعديلين بعد الترجمة: بقايا حمض γ-carboxyglutamic مباشرة قبل أول بقايا Cys وهيدروكسي برولين في الموضع 16. ثالثًا ، هناك بقايا موجبة الشحنة ، Arg ، في الموضع 12 ، بينما α-CTx GIC ومعظم تحتوي سموم ألفا إما على بقايا كارهة للماء (Ala أو Phe) أو غير مشحونة (Asn). ومن المثير للاهتمام ، أن الشحنة الموجبة في هذا الموضع تبدو مسؤولة عن تقارب α-CTx GID المرتفع نسبيًا لـ α4β2 nAChRs مقارنةً بسموم ألفا الأخرى التي تفتقر إلى هذه البقايا الإيجابية 92 ، 93. من الجدير بالذكر هنا أن اثنين من الذيفانات α-conotoxins-SrIA و SrIB-الخاصين بالعضلات - اللذان لهما تأثيرات قوية على α4β2 nAChR لهما أيضًا Arg في الموضع المتماثل (الجدول 1). تشير أيضًا 'مسيرة Ala' لـ α-CTx GID إلى أدوار مهمة لمعظم بقايا السم ، باستثناء Val13 ، في التفاعل مع α4β2 nAChR 93. على غرار α-CTx GIC ، تحجب α-CTx GID أيضًا بشكل فعال α32 nAChR 92 ، 93. على عكس α-CTx GIC ، فإن α-CTX GID يحظر أيضًا α7 nAChR 92 ، 93. تشير دراسات الهيكل والنشاط إلى أن أهم بقايا للتفاعل مع كل من α7 و α3β2 nAChRs هي Pro9 ، مع مساهمة أصغر من Asp3 و Arg12. يبدو أن Asn14 مهم للتفاعل مع α7 nAChR فقط 93. إن بقايا الوحدة الفرعية β2 التي تمنح الفاعلية العالية لـ α-CTx GID على α3β2 nAChR هي نفس البقايا التي تمنح أيضًا فاعلية عالية لـ α-CTx MII و α-CTx PnIA لهذا النوع الفرعي للمستقبل 75.

Α-Conotoxin EpI

α-CTx EpI ، α4 / 7-conotoxin تمت تنقيته من السم Conus episcopatus، هو مثال آخر على السموم الخبيثة المعدلة بعد الترجمة. يختلف هذا السموم عن السموم المخروطية التي تم تمييزها سابقًا من حيث أنه يحتوي على Tyr مكبريت في الموضع 15 94. ومع ذلك ، يتشابه كل من الببتيد الأصلي غير المكبريت والاصطناعي غير الكبريت في النشاط ويمنع استجابات nAChR المقاومة لـ α-bungarotoxin في خلايا chromaffin الكظرية والخلايا العصبية السمبثاوية داخل القلب الجرذان ، ولكنها لا تمنع استجابات NAChR للعضلات 94. لذلك ، تم تصنيف هذا السم كمانع محدد لـ α3β2 و α3β4 ، ولكن ليس α7 ، nAChRs. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات مع nAChRs المعبر عنها بشكل غير متجانس في البويضات الانتقائية العكسية والتثبيط القوي لـ α7 nAChRs مع تأثير ضئيل على α3β4 أو α3β2 nAChRs 95. إن تثبيط α7 nAChRs بواسطة α-CTx EpI ليس مفاجئًا بالنظر إلى أن α-CTx EpI مطابق لـ α-CTx ImI في الحلقة الأولى ، المنطقة التي تحتوي على بقايا أظهرت أنها مهمة لتفاعل α-CTx ImI مع α7 nAChRs 41 .

Α-Conotoxins AnIA و AnIB و AnIC

عزل ثلاثة ببتيدات من سم شقائق النعمان كونوس أضف إلى قائمة السموم الكبريتية 96. يحتوي كل من α-CTx AnIA و α-CTx AnIB و α-CTx AnIC على سلفوتيروزين في الموضع 16. تتمتع α-CTx AnIB الاصطناعية بفاعلية subnnomolar عند α3β2 nAChRs ، مع فعالية أقل بحوالي 200 ضعف عند α7 nAChR ، وقليل أو لا يوجد نشاط على العضلات وغيرها من NAChRs غير المتجانسة المختبرة. احتفظ الببتيد غير الكبريت بالنشاط عند α3β2 nAChRs ، بينما كان أقل قوة بمقدار 10 أضعاف على α7 nAChR. أثرت إزالة اثنين من الجلايسينات الطرفية N (لإنتاج نفس السم مثل α-CTx AnIA) سلبًا على حركية الربط ، ونتيجة لذلك فاعلية السم على α3β2 nAChRs 96.

Α-Conotoxins AuIA و AuIB و AuIC

ثلاثة ألفا كونوتوكسين معزولة من سم Conus aulicus هي α-CTx AuIA و AuIB و AuIC. على غرار معظم nAChR العصبية الأخرى التي تحجب α-conotoxins ، تنتمي α-CTx AuIA و AuIC إلى عائلة α4 / 7 ، في حين أن α-CTx AuIB لها تباعد حلقة غير عادية 4/6 inter-cysteine ​​72. الثلاثة جميعهم حاصرات انتقائية للنوع الفرعي العصبي ، α3β4 ، مع α-CTx AuIB هو الأكثر فعالية 72. تم استخدام ذيفان ألفا كونوتوكسين هذا لإظهار تورط أنواع فرعية من nAChR المتميزة في تعديل [3 H] NE ، [3 H] ACh ، و [3 H] DA من الحصين والنواة بين القطارات والمشابك القاتلة ، على التوالي 72 ، 97.

Α-Conotoxins PnIA و PnIB

تمت تنقية α-CTx PnIA و PnIB من سم كونوس بيناسيوس 98. يحتوي كلا السمين على تعديل ما بعد الترجمة ، سلفوتيروزين في الموضع 15 99 ، ومع ذلك ، تم إجراء جميع التوصيفات الوظيفية باستخدام سموم اصطناعية غير مكبريتية. على الرغم من اختلافهما فقط في اثنين من الأحماض الأمينية ، فإن α-CTx PnIA هو مانع قوي لـ α3β2 nAChR ، بينما يقوم α-CTx PnIB بحظر α7 nAChR بشكل أكثر فعالية 100.

استبدال Ala10 في α-CTx PnIA بـ Leu ، الموجود في الموضع المتماثل في α-CTx PnIB ، يغير انتقائية α-CTx PnIA [A10L] نحو α7 ، بقوة أكبر من α-CTx PnIB 100 ، 101 . يؤثر الاقتطاع المنهجي للحلقة الثانية على فاعلية α-CTx PnIA [A10L] لكل من α7 nAChR و AChBP بسبب فقدان العديد من الروابط الهيدروجينية بين السم والمستقبل عند اقتطاع السموم 102. استبدال Asn11 بـ Ser في α-CTx PnIA ، تسبب البقايا الأخرى المختلفة بين α-CTx PnIA و α-CTx PnIB ، في فقدان الفاعلية لكل من α3β2 و α7 nAChRs 100.

حددت دراسات الهيكل والنشاط المخلفات في الوحدة الفرعية α3 التي تمنح تقاربًا لـ α-CTx PnIA. وتشمل هذه Pro182 و Ile188 (وجد أيضًا أنه يتفاعل مع α-CTx MII) و Gln198 103. تم العثور على جميع البقايا الثلاثة داخل الحلقة C للوحدة الفرعية. بقايا الوحدة الفرعية β2 التي تتفاعل مع α-CTx PnIA هي نفس البقايا التي تتفاعل أيضًا مع α-CTx MII و α-CTx GID 75. أدت إضافة شحنة موجبة إضافية إلى الطرف C لـ α-CTx PnIA [A10L] لإنتاج التناظرية α-CTX PnIA [A10L ، D14K] إلى تعزيز ألفة السم لـ ليمنيا و أبليسيا AChBPs 33 ، 104. قدمت دراسة حديثة التركيب البلوري لـ α-CTx PnIA [A10LD14K] المرتبط به أبليسيا AChBP وأشار في الغالب إلى التفاعلات الكارهة للماء والطارئة للماء / العطرية بين التناظرية وجيب ربط AChBP 104. أشار تحليل متحولة الدورة المزدوجة أيضًا إلى تفاعلات زوجية كارهة للماء والعطرية بين α-CTx PnIB و α7 nAChR 105.

ألفا كونوتوكسين BuIA

تم استنساخ α-CTx BuIA من الحمض النووي الريبي المستخرج من سم كونوس بولاتوس 106. على غرار العضلات nAChR التي تحجب α-CTx PIB ، فإنها تمتلك تباعدًا في حلقة السيستين 4/4. على عكس السموم الأخرى من α-conotoxins ، فإن α-CTx BuIA ليس محددًا لنوع فرعي معين من nAChR ، مما يحجب جميع الأنواع الفرعية العصبية تقريبًا بقوة نانومولار ، باستثناء α4β2106. ومع ذلك ، يمكن للحركية التفاضلية التمييز بين nAChRs التي تحتوي إما على β2 أو وحدة فرعية β4: يتم عكس كتلة β2 * nAChRs بسرعة بينما يتم عكس كتلة β4 * nAChRs ببطء فقط عند غسل السموم 106. تم تحديد بقايا الوحدة الفرعية التي تعتبر بالغة الأهمية لهذه الاختلافات خارج المعدل ، ومن المثير للاهتمام ، أنها نفس البقايا التي تتفاعل مع عدد من السموم α-conotoxins الأخرى 75 ، 107. حلت دراستان هيكل α-CTx BuIA 108 ، 109. أظهرت الدراسة الأخيرة أن البنية الكروية الأصلية لـ α-CTx BuIA مرنة للغاية وتحافظ على مطابقة متعددة في المحلول ، على عكس بعض السموم الأخرى التي لها بنية كروية صلبة 109. هذه الميزة الهيكلية متعددة التشكل قد تكمن وراء المظهر الانتقائي المختلط للسم.

تم استخدام الحركية التفاضلية لـ α-CTx BuIA لتحديد مدى مشاركة الوحدات الفرعية β2 و 4 في nAChRs على أطراف نورادرينرجيك الفئران والماوس. أشارت هذه الدراسات إلى وجود الوحدة الفرعية β4 في جميع nAChRs على أطراف الفئران ، ولكن وجودها في 60 ٪ فقط من أطراف الماوس nAChRs 73.

Α-Conotoxins PeIA و RgIA و Vc1.1

تم اكتشاف ثلاثة سموم ألفا تم اكتشافها حديثًا لاستهداف α9α10 nAChR ، وهو نوع فرعي يتميز بعلم الأدوية غير المعتاد مقارنةً بـ NAChRs الأخرى 110 ، 111. α-CTx PeIA ، مستنسخ من سم Conus pergrandis، كتل معبر عنها بشكل متغاير α9α10 nAChRs ، بالإضافة إلى α9α10 nAChRs الأصلية في خلايا الشعر القوقعة مع IC50s من حوالي 7 و 4 نانومول / لتر ، على التوالي 112. ومع ذلك ، فإن هذا السم هو أيضًا مانع قوي لـ α3β2 و α6 / α3β2β3 nAChRs ، مع IC50s من حوالي 23 و 30 نانومول / لتر ، على التوالي 112.

α-CTx RgIA ، مستنسخة من سم أنواع صيد الديدان البحرية كونوس ريجيوس، هو سم مخروطي آخر α4 / 3 مشابه لـ α-CTx ImI (الشكل 1) ومع ذلك ، على عكس α-CTx ImI ، فهو مانع أقوى بكثير لـ α9α10 من α7 nAChRs 113 وأكثر مضادات α9α10 انتقائية تم الإبلاغ عنها حتى الآن. α-CTx Vc1.1 ، مستنسخ من سم كونوس فيكتوريا، هو ذيفان α4 / 7 تم عرضه في الأصل لعرقلة nAChRs الموجودة في خلايا chromaffin الكظرية 114 ، 115. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع هذا الببتيد الاستجابات الالتهابية الوعائية الناتجة عن التحفيز الكهربائي للأعصاب الحسية غير المبطنة 114. أشار التوصيف الدوائي الإضافي لسم ألفا كونوتوكين هذا إلى أنه مثبط قوي لـ α9α10 nAChR 116 ، 117. على عكس α-CTx RgIA ، مع ذلك ، تحتوي α-CTx Vc1.1 الأصلية (المشار إليها باسم Vc1a) على ثلاثة تعديلات ما بعد الترجمة: هيدروكسي برولين في الموضع 6 ، و car-carboxyglutamate في الموضع 14 و C-terminus 117. تم إثبات أن كلا من α-CTx RgIA و α-CTx Vc1.1 هما عاملان مسكنان فعالان في نموذج الفئران لإصابة الأعصاب 116 و 117 و 118 و α-CTx Vc1.1 (اسم الدواء ACV1) دخلت المرحلة الثانية من التجارب السريرية البشرية لـ 119- علاج آلام الأعصاب. ومع ذلك ، فقد تم تحدي دور α9α10 nAChRs في التوسط في هذا التأثير المسكن.

أشارت بيانات نشاط الهيكل مع α-CTx RgIA إلى أن هذا السم يرتبط بموقع ربط ACh على المستقبل وأن بقايا السموم Asp5 و Pro6 و Arg7 و Arg9 مهمة للتفاعل مع α9α10 nAChRs 121. يؤكد الهيكل ثلاثي الأبعاد المنشور مؤخرًا لـ α-CTx RgIA أيضًا دورًا مهمًا لـ Arg9 في التفاعل مع المخلفات سالبة الشحنة في α9α10 nAChR 122. فرق نقل التشبع دراسات NMR التي تفحص ارتباط α-CTx Vc1.1 بـ Lymnaea stagnalis يشير AChBP ، وهو متجانس بنيوي وثيق لموقع ربط α7 nAChR ، إلى دور Tyr10 في الارتباط بـ AChBP 123. ومن المثير للاهتمام ، أن هذه البقايا في α-CTx RgIA لا يبدو أنها مهمة للتفاعل مع α9α10 nAChRs 121.

ألفا كونوتوكسين TxIA

α-CTx TxIA ، من سم نسيج كونوس، تم اكتشافه مؤخرًا باستخدام نهج جديد لتحديد السموم الخبيثة الجديدة من السم الخام 124. في هذا النهج ، فإن سم نسيج كونوس تم فحصه مقابل ليمنيا AChBP في اختبار ملزم للمنافسة باستخدام 125 I-α-bungarotoxin. أشار التوصيف الكيميائي الحيوي إلى أن α-CTx TxIA ينتمي إلى عائلة السموم المخروطية α4 / 7 وله نفس ترتيب السيستين وتوصيل ثاني كبريتيد الشائع مع السموم الأخرى في هذه العائلة. أشارت الاختبارات الملزمة والوظيفية إلى أن ألفة هذا السم لـ ليمنيا كان AChBP (1.7 نانومول / لتر) أعلى من السموم الأخرى التي تم تحديدها سابقًا ، وأن α-CTx TxIA كان له فاعلية عالية لـ α3β2 nAChRs. دراسات التركيب والنشاط ، جنبًا إلى جنب مع التبلور المشترك لنظير α-CTxIA ، α-CTx TxIA [A10L] ، مع أبليسيا أشار AChBP إلى دور مهم لبقايا كارهة للماء طويلة السلسلة في الموضع 9 أو 10 و Arg في الموضع 5 لتقارب السموم لـ AChBP و α7 ، ولكن ليس α3β2 ، nAChRs 124

ألفا كونوتوكسين Lp1.1

تم استنساخ α-CTx Lp1.1 من كل من DNA الجينومي و cDNA لـ النمر المخروطي 125. على الرغم من أنه ينتمي إلى عائلة السموم المخروطية α4 / 7 ، إلا أن تسلسله الأساسي فريد من نوعه من حيث أنه يفتقر إلى Ser و Pro المحفوظين الموجودان في الحلقة الأولى لجميع السموم العصبية النشطة المعروفة α-conotoxins (الجدول 2). تسبب هذا السم في السباحة غير المنسقة عند حقنها في العضل في الأسماك. عند التركيزات العالية يسبب النوبة والشلل 126. ومن المثير للاهتمام ، أن مادة α4 / 7 أخرى (LeD2) معزولة عن نوع مختلف كونوس محيط، كونوس ليتيراتوس، له نفس التسلسل Lp1.1 127.

Α-Conotoxins ArIA و ArIB

حددنا مؤخرًا نوعين من السموم الخيطية الجديدة من سم كونوس أريناتوسو α-CTx ArIA و α-CTx ArIB 128. كلاهما ينتمي إلى عائلة α4 / 7 Conotoxin وهما من الحاصرات القوية لـ α7 nAChR. ومع ذلك ، فإن كلا السمين يحجبان أيضًا α3β2 nAChR بقوة نانومولار 128. تم استخدام تحليل البنية والوظيفة لإنشاء نظارين من α-CTx ArIB و α-CTx ArIB [V11L V16A] و α-CTx ArIB [V11L V16D] ، والتي لها تقارب كبير مع α7 nAChRs ولكن لها نشاط منخفض نسبيًا على α3β2 nAChRs 128 . بالمقارنة مع α-bungarotoxin ، مع ذلك ، فإن الحركية غير المعدلة الأسرع لنظائر α-CTx ArIB تجعلها روابط مفيدة في تجارب ربط التوازن. تحجب α-CTx ArIB [V11L V16D] الجرذان والفأر والبشر nAChRs 128 ، 129. تم أيضًا تطوير نسخة ذات علامات إشعاعية ، 125 I-α-CTx ArIB [V11L V16A] ، 130.


جوهر

مقدمة للمستقبلات

أ مستقبل هو جزيء بروتيني يربط جزيء الإشارة الكيميائية - يسمى أ يجند - ويخضع لتغيير توافقي ينشط مسار الإشارات لإحداث استجابة خلوية في النهاية. غالبًا ما يتبع تنشيط المستقبل أ الرسول الثاني الإنتاج ، والذي قد ينشط شلالات الإشارات داخل الخلايا - تُعرف هذه العملية باسم نقل الإشارة.

هناك عدة فئات من المستقبلات:

  • مستقبلات البروتين جي
  • مستقبلات التيروزين كيناز
  • القنوات الأيونية ليجند
  • المستقبلات داخل الخلايا

هذه المقالة سوف تركز على مستقبلات البروتين جي ومسارات الإشارات الخاصة بكل منها.

هيكل GPCRs و G- البروتينات

المستقبلات المقترنة بالبروتين G ، والمعروفة أيضًا باسم مستقبلات 7-TM ، هي مستقبلات سطح الخلية (أي أنها موجودة على غشاء البلازما). يتكون GPCR من ملف عديد ببتيد واحد سلسلة مع طرف N خارج الخلية ، طرف C داخل الخلايا و 7 مجالات عبر الغشاء. يمكن تشكيل موقع ربط الترابط إما عن طريق نطاقات الغشاء الثاني والثالث.

صورة - بنية مستقبلات G-protein المقترنة داخل غشاء ، تُظهر مجالات الغشاء السبعة

SimpleMed الأصلي من تأليف Thomas Burnell

بروتينات G ، والمعروفة أيضًا باسم بروتينات ربط النوكليوتيدات الجوانين ، هي بروتينات الغشاء المحيطي. تتكون من 3 وحدات فرعية: أ ألفا الوحدة الفرعية وأ بيتا جاما الوحدة الفرعية (يتم دمج الوحدات الفرعية بيتا وجاما معًا بشكل دائم).

نقل الإشارة

عندما يرتبط ligand (ناهض في هذه الحالة) بـ GPCR ، يخضع GPCR ل تغيير متعلق بتكوين ويقال أنه تم تنشيطه. يمكن تلخيص ذلك بالمعادلة R = & GT R *. ثم يتفاعل GPCR المنشط مع بروتين G المرتبط به عن طريق التسبب GTP لتبادل الناتج المحلي الإجمالي على بروتين G ألفا الوحدة الفرعية. ينتج عن تبادل GTP-GDP هذا فصل الوحدات الفرعية ألفا وبيتا جاما. يمكن بعد ذلك الاستمرار في تنشيط هذه الوحدات الفرعية لتنشيط مختلف المستجيب البروتينات - وتشمل هذه الإنزيمات المرسال الثاني والقنوات الأيونية.

رسم بياني - تفعيل وتعطيل GPCR

SimpleMed الأصلي بواسطة جوش براي

تعمل الأنواع المختلفة من بروتين G على تنشيط مسارات إشارات مختلفة. بشكل عام ، سيكون للوحدة الفرعية G-alpha تأثير تحفيزي أو مثبط على إنزيم يولد جزيء رسول ثان والذي سيستمر بعد ذلك في تنشيط سلاسل إشارات مختلفة. قد تشارك الوحدة الفرعية beta-gamma أيضًا في إرسال الإشارات ، ولكن في هذه المقالة سنركز على ألفا الوحدة الفرعية.

يوجد 3 أنواع فرعية رئيسية من بروتين G-alpha:

جيس: ال جي ألفاس بروتين ينشط الانزيم adenylyl cyclaseالذي يولد الرسول الثاني ، دوري AMP (معسكر) من ATP. ينشط cAMP بروتين كيناز أ (PKA) بإلزامها وإعفائها من وحداتها الفرعية التنظيمية. PKA هو إنزيم كيناز الفوسفوريلات البروتينات المختلفة ، مما يؤدي إلى تنشيط أو تثبيط البروتين المستهدف. قد يكون هذا التفاعل جزءًا من سلسلة إشارات أكبر.

جيأنا: ال جي ألفاأنا البروتين الأوليمنع انزيم adenylyl، مما يسبب انخفاض المخيم جيل وبالتالي انخفاض نشاط PKA.

جيف: ال جي ألفاف بروتين ينشط الانزيم فسفوليباز ج، والذي يحول PIP2 (فوسفوليبيد) ل IP3 و DAG (الرسل الثاني). ارتفاع في الملكية الفكرية3 يتبعه بشكل عام يزيد في الكالسيوم داخل الخلايا لأنه يحفز إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية الملساء (انظر مقال عن نقل الغشاء وإشارات الكالسيوم).

رسم تخطيطي - مسارات تنشيط المصب المشتركة لمستقبلات البروتين G المقترنة. في هذا الرسم التخطيطي ، تشير الخطوط المنتهية بأسهم (مثل العمل على محلقة adenylyl في Gs) إلى زيادة في الإجراء ، وتشير الخطوط المنتهية في شكل "T" (مثل العمل على cyclase adenyly في Gi) إلى انخفاض في الإجراء.

SimpleMed الأصلي من تأليف Thomas Burnell

من أجل إنهاء الإشارة ، تحتوي وحدة G-alpha الفرعية على امتداد مجال GTPase الجوهري، والذي يحلل ببطء GTP المربوط إلى الناتج المحلي الإجمالي. بمجرد اكتمال التحلل المائي ، يتم إعادة تجميع الوحدات الفرعية ألفا وبيتا جاما وتصبح غير نشطة مرة أخرى ، مما يؤدي إلى إنهاء الإشارة.

هذا إعلان - نستخدمه لإبقاء SimpleMed مجانيًا! إذا رأيت شيئًا يعجبك ، فالرجاء النقر فوقه - فهو يدعم الموقع :)

تضخيم الإشارة

تعني ظاهرة تضخيم الإشارة أنه لا يلزم سوى عدد قليل من جزيئات الترابط لاستنباط استجابة خلوية كبيرة نسبيًا.

يتم تحقيق تضخيم الإشارة عبر شلالات الإشارات، حيث يقوم أحد الإنزيمات بتنشيط إنزيم آخر ، والذي بدوره سينشط إنزيمًا آخر ، وهكذا. يتم تضخيم الإشارة في كل مستوى من مستويات السلسلة حيث أن جزيء إنزيم واحد قادر على تنشيط عدة جزيئات بروتينية أخرى.

أمثلة ذات صلة سريريًا

GPCRs مهمة في استجابة الأنسجة ل الجهاز العصبي اللاإرادي. يمكن أن تعبر الأنسجة المستقبلات الكظرية - التي تستجيب للافراج عن تعاطف (ولا)الأدرينالين - و / أو مستقبلات المسكارينية، والتي تستجيب للافراج عن نظير السمبثاوي أستيل (ACh). يمكن تذكر اقتران هذه المستقبلات ببروتينات G الخاصة بها باستخدام قيس QIQ’.

  • ألفا 1 = & GT Gف
  • ألفا 2 = & GT Gأنا
  • بيتا 1 = & GT Gس
  • بيتا 2 = & GT Gس
  • م 1 = & GT Gف
  • م 2 = & GT Gأنا
  • م 3 = & GT Gف

الجدول - ملخص لـ GPCRs

SimpleMed الأصلي بواسطة جوشوا براي

مستقبلات ألفا 1 الأدرينالية يتم التعبير عنها في العضلات الملساء الشريانية المحيطية - يؤدي تحفيز هذه المستقبلات إلى تقلص العضلات الملساء ويترتب على ذلك تضيق الأوعية.

مستقبلات بيتا 1 الأدرينالية يمكن العثور عليها في قلب - سيؤدي تحفيز هذه المستقبلات إلى حدوث التهاب زيادة في معدل ضربات القلب والانقباض.

مستقبلات بيتا 2 الأدرينالية يمكن العثور عليها في العضلات الملساء القصبي و أيضا العضلات الوعائية الملساء في الشرايين التي تزود عضلات الهيكل العظمي و عضلة القلب (أي الشرايين التاجية) - يؤدي تحفيز هذه المستقبلات إلى استرخاء العضلات الملساء وبالتالي توسع القصبات و توسع الأوعية على التوالى.

تذكر: 'قلب واحد ورئتان(Beta-1 ، Beta-2).

ال قلب يعبر أيضا مستقبلات M2 - سيؤدي تحفيز هذه المستقبلات إلى حدوث معدل ضربات القلب في الانخفاض.


مستقبلات المسكارين M3

يرتبط مستقبل المسكارين M3 (AChM3R) ، على غرار AChM1R ، في الغالب ببروتينات Gq (الجدول 1). يربط هذا الاقتران AChM3R بإنزيم الغشاء phosphoinositidase C β (PIC-β) ، حيث يؤدي تنشيط AChM3R إلى تعزيز نشاط PIC-، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين IP3 و DAG. كما ذكرنا سابقًا ، يعمل هذان الجزيئان كمرسلين ثانيين لتعبئة مخازن Ca 2+ داخل الخلايا وتنشيط مسار PKC (81 ، 96). يتم التعبير عن AChM3R على نطاق واسع في العديد من الأنسجة المركزية والمحيطية وبالتالي يشارك في مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية والعضوية (62). ومع ذلك ، على غرار AChM1R ، هناك بعض الأدلة التي تشير إلى أن اقتران AChM3R ببروتينات G منحل وأن فاعلية ناهض تتأثر بكمية ونوع البروتينات G المتاحة. لذلك ، لا يلعب اقتران البروتين G دورًا مهمًا في الاستجابات الفسيولوجية فحسب ، بل تؤدي أيضًا الاختلافات في تركيب الأنسجة أيضًا (81). نظرًا لتعقيدات الإشارات والتوطين المكتشف حديثًا لـ AChM3R ، لا يزال دوره الفسيولوجي داخل الجسم والمشاركة المحتملة في العديد من الأمراض موضع تحقيق مكثف (88).

كان دور AChM3R في القلب موضوع اهتمام العلماء منذ تحديده الأولي. توزيع AChM3R داخل القلب هو مرنا مميز تمامًا لـ AChM3R تم العثور عليه في جميع أنحاء الأذين والبطينين في قلب الإنسان ، على الرغم من ظهور mRNA لـ AChM2R بكثرة (105 ، 111). تظهر النتائج أن تعبير مستقبلات AChM3R لا يتم توزيعه بشكل موحد في جميع أنحاء القلب ولكن يتم التعبير عنه أعلى بمقدار 10 أضعاف داخل البطينين منه في الأذين. بالإضافة إلى ذلك ، تشير تجارب المناعة على الخلايا العضلية البطينية البشرية إلى أن AChM3R وجد أنه يركز على الأقراص المقحمة مقارنة بالمناطق الأخرى من غشاء الخلية (110). أدى اهتمام الباحثين إلى اكتشاف وظائف عديدة لمستقبلات AChM3R القلبية. لا ينشط AChM3R مسار PKC فحسب ، بل ينشط أيضًا تيار البوتاسيوم المتأخر ، مما يساعد في تنظيم معدل ضربات القلب وإعادة الاستقطاب (8 ، 11 ، 111). تم الإبلاغ أيضًا عن تنشيط AChM3R في الفئران ليكون له تأثيرات واقية للخلايا ضد إصابة عضلة القلب ، وخاصة تلك المرتبطة بنقص التروية. تم عكس هذه النتائج مع العلاج بمضاد AChM3R (120). تشير الدراسات إلى أن تنشيط AChM3R القلبي يمكن أن ينشط العديد من جزيئات البقاء على قيد الحياة مثل BCL-2 و ERKs مما يزيد من مضادات الأكسدة التي تقلل من وسطاء موت الخلايا المبرمج ، و Fas و p38 MAPK وتقليل الحمل الزائد Ca 2+ (111 ، 120). يشير التوزيع على القرص المقحم إلى أن AChM3R له أيضًا دور في اتصال الخلية الخلوية عند تقاطع الفجوة. في هذه المنطقة ، تشير دراسات الترسيب المناعي المشترك إلى وجود ارتباط بين AChM3R و Connexin 43 ، وهي قناة تقاطع فجوة. يُقترح أن هذا التفاعل قد يكون مفيدًا في تنسيق معدلات عودة الاستقطاب للخلايا العضلية القلبية (124). تشير بعض الدراسات إلى أن المستقبلات المقترنة ببروتين Gq المرتبطة بـ PIC-تخضع لعملية إزالة حساسية سريعة ، يحتمل أن يكون سببها تراكم ثنائي الطور لـ IP3. لذلك ، تبدو وظيفة AChM3R داخل القلب متنوعة ، ولكن لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم كيفية تأثير إزالة التحسس وعوامل أخرى مثل تغيرات التعبير والعزل على نقل إشارة AChM3R من حيث صلته بأدواره الفسيولوجية الطبيعية (الشكل 1) (81) ، 82 ، 88).

رسم بياني 1.يعمل مستقبل الأسيتيل كولين M3 المسكاريني (AChM3R) في نظام القلب. يمكن أن يؤدي تنشيط AChM3R إلى تنشيط العديد من جزيئات البقاء على قيد الحياة مثل BCL-2 و ERKs ، مما يقلل من وسطاء موت الخلايا المبرمج ، و Fas و p38 MAPK ويقلل من الحمل الزائد Ca 2+ ، مما يؤدي إلى حماية الخلايا وتحسين وظائف القلب. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون الارتباط بين AChM3R و Connexin-43 ، وهي قناة تقاطع فجوة ، مفيدًا في تنسيق معدلات عودة الاستقطاب لخلايا عضلة القلب. من ناحية أخرى ، يعمل تنشيط AChM3R على تنشيط تيار البوتاسيوم المتأخر ، مما يساعد في تنظيم معدل ضربات القلب وإعادة الاستقطاب.

يمكن أيضًا العثور على AChM3R داخل نظام الأوعية الدموية ، على وجه التحديد ، في كل من طبقة الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMC). ومن المثير للاهتمام ، أن هذا التوزيع ينتج استجابة تعتمد بشكل أساسي على البطانة في القطط ، ويؤدي تنشيط AChM3R مع بطانة سليمة إلى توسع الأوعية ، في حين أن تنشيط العضلات الملساء في حالة عدم وجود البطانة يؤدي إلى تضيق الأوعية (24 ، 48). على الرغم من أنه من الممكن أن يحدث الاسترخاء المعتمد على البطانة من خلال العديد من موسعات الأوعية ، NO ، عامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة ، والبروستاسكلين ، فقد أفادت دراسة أجريت على الفئران بالضربة القاضية المسكارينية (KO) أن AChM3R توسط في توسع الأوعية في الشرايين الفخذية والأبهرية من خلال NO وحده (6). ). من المقبول على نطاق واسع أن AChM3R في خلايا العضلات الملساء يؤدي إلى زيادة الكالسيوم 2+ ، مما يؤدي إلى انقباض ، ولكن الأوعية الدموية توفر حالة فريدة حيث ينتشر أكسيد النيتروجين من الخلايا البطانية إلى VSMC ، مما يسمح بالتمدد (الشكل 2) (38) ). لقد أوضحت فحوصات النفاذية في المختبر AChM3R في وظيفة الحاجز البطاني ، وتحديداً التصاق الخلية الخلوية بوساطة E-cadherin. أظهر التعرض المطول لـ 1،1-dimethyl-4-diphenylacetoxypiperidinium iodide (4-DAMP) ، مع نشاط مضاد AChM3R ، انخفاضًا في نفاذية البطانة (16 ، 57). وهكذا ، في الأمراض التي تتضرر فيها طبقة البطانة أو تُزال ، يؤدي تنشيط AChM3R على VSMCs إلى تضيق الأوعية (38). مثل AChM2R ، فإن AChM3R السابقة للوظيفة متورطة أيضًا في استرخاء الشريان الدماغي (2). ومن المثير للاهتمام ، أن التجارب في الشرايين الدماغية في الأبقار أفادت بأن AChM3R يثبط إفراز الأسيتيل كولين والنورادرينالين ، مما يشير إلى أن AChM3R له وظيفة تنظيمية تتوسط في كل من انقباض وتمدد الشرايين الدماغية (33).

الصورة 2.لا يوجد مسار تخليقي حيوي محفز بالمستقبلات في الخلايا البطانية وتأثيراته على العضلات الملساء الوعائية. تقوم الخلية البطانية بتحويل استجابة Gq (زيادة Ca 2+) إلى استجابة Gs (زيادة AMP الدوري) ، وهو تأثير غير مباشر لتحفيز AChMR على العضلات الملساء الوعائية لإنتاج توسع الأوعية الدموية. ACh ، أسيتيل كولين Ca 2+ ، الكالسيوم L-Arg ، L- أرجينين eNOS ، سينثيز أكسيد النيتريك البطاني ، أكسيد النيتريك cGMP ، cAMP أحادي الفوسفات الغوانيدين الدوري ، أحادي فوسفات الأدينوزين الدوري.


نتائج

الوحدات الفرعية α7 على سطح الخلية التي لا تربط Bgt

ينتج عن التعبير غير المتماثل للوحدات الفرعية α7 في العديد من خطوط الخلايا المختلفة تعبيرًا ضئيلًا أو معدومًا عن مواقع ربط Bgt (Cooper and Millar 1997 Rangwala et al. 1997). في المقابل ، التعبير عن وحدة فرعية خيمرية ، تتكون من NH خارج الخلية2- النصف النهائي للوحدة الفرعية α7 والنصف الطرفي COOH من 5HT3 الوحدة الفرعية ، تنتج مستويات عالية من مواقع ربط Bgt (Corringer et al. 1995 Rangwala et al. 1997). لمعالجة ما إذا كانت الوحدات الفرعية α7 التي تفتقر إلى مواقع ربط Bgt تصل إلى سطح الخلايا ، قمنا بتوليد بروتين اندماج للوحدة الفرعية α7 مع علامة حلقية HA على محطة COOH (α7-HA). تم أيضًا دمج نفس علامة حلقية HA في نهاية COOH الخاصة بـ α7 / 5HT3 الوحدة الفرعية الوهمية. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، كان من المتوقع أن يكون لحلقة HA ​​موقع خارج الخلية ، بالنظر إلى طبولوجيا الغشاء المتوقعة. خلايا سليمة تعبر عن α7 / 5HT3- تم تلطيخ الوحدات الفرعية HA بشكل مكثف بواسطة مضاد HA mAb (الشكل 1 ب) ، وخلصنا إلى أن حاتمة HA ونهاية COOH الخاصة بـ α7 / 5HT3توجد وحدات HA الفرعية في المجال خارج الخلية للمستقبل. تعداء عابر لـ α7 / 5HT3ينتج عن الوحدات الفرعية -HA في خلايا tsA201 التعبير في -50٪ من الخلايا كما هو محدد من خلال مقارنة تلطيخ نوى DAPI (الشكل 1 ب ، اللوحات اليسرى) مع تلطيخ مضاد لـ HA mAb. تمشيا مع ارتباط Bgt بهذه المستقبلات ، كانت جميع الخلايا الملطخة بمضاد HA mAb ملطخة بشدة أيضًا بواسطة TMR-Bgt (الشكل 1 ب ، الألواح الوسطى).

في ضوء النتائج السابقة التي تفيد بأن التعبير عن الوحدات الفرعية α7 لا ينتج مواقع ربط Bgt ، كان من المدهش أن تكون أعدادًا كبيرة من الخلايا المصابة بالوحدة الفرعية α7-HA ملطخة بشكل إيجابي باستخدام مضاد HA mAb (الشكل 1 ب). كما هو متوقع ، لا توجد خلايا ملطخة إيجابية بـ TMR-Bgt. وبالتالي ، فإن الوحدات الفرعية α7-HA الموجودة على سطح هذه الخلايا تفتقر إلى مواقع ربط Bgt. الكميات النسبية لسطح الخلية α7-HA و α7 / 5HT3تم تحديد الوحدات الفرعية -HA باستخدام مضاد HA mAb و 125 I-protein A. يوضح الشكل 1 C أن α7 / 5HT3كان تعبير الوحدة الفرعية -HA أعلى بستة أضعاف من تعبير الوحدة الفرعية α7-HA. سبب الاختلاف في مستويات التعبير السطحي غير واضح ، لكنه ليس بسبب الاختلافات في معدلات α7-HA و α7 / 5HT3- تخليق الوحدة الفرعية HA (انظر الشكل 3 والشكل 4).

مجمعات الوحدة الفرعية السطحية α7 لا تعمل

نظرًا لأنه يتم نقل أعداد كبيرة من الوحدات الفرعية α7 إلى سطح الخلايا المنقولة ، فقد درسنا ما إذا كانت هذه الوحدات الفرعية تشكل مستقبلات وظيفية. اختبرنا حساسية النيكوتين لخلايا tsA201 المنقولة باستخدام α7 / 5HT3-هيكل و ملطخ بالأجسام المضادة لـ HA. في تسجيلات المشبك ذات الجهد الكامل للخلية ، استجابت 15 خلية من 15 خلية للنيكوتين بتيارات داخلية قوية تعمل على إزالة الحساسية في ظل استمرار وجود ناهض ، كما هو متوقع للاستجابة بوساطة AChR (الشكل 2 أ). في نفس الثقافات ، لم تستجب الخلايا التي لم تصبغ إيجابية بالأجسام المضادة لـ HA لتطبيق النيكوتين (⁠

الاختلافات في α7 و α7 / 5HT3 حالة الوحدة الفرعية للاختزال

لتحديد أساس الاختلافات بين α7-HA و α7 / 5HT3-HA الوحدات الفرعية ، أجرينا سلسلة من التجارب التي قارنت معالجة الوحدتين الفرعيتين. بالنسبة إلى AChR من النوع العضلي ، يتطلب تكوين موقع ربط Bgt ربط ثنائي كبريتيد من بقايا سيستين في خارج الخلية ، NH2- المجال النهائي للوحدة الفرعية α1 (Mishina et al. 1985 Sumikawa and Gehle 1992 Green and Wanamaker 1997). لأنه تم العثور على مجموعة متجانسة من بقايا السيستين في خارج الخلية NH2- المجال النهائي لـ α7 و α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية ، اختبرنا ما إذا كانت الوحدات الفرعية تختلف في حالة الأكسدة والاختزال الخاصة بها. إذا كان العامل المؤلكل ، ن-ethylmaleimide (NEM) ، غير موجود أثناء إذابة الوحدات الفرعية المسمى ، كان هجرة الوحدات الفرعية α7 على المواد الهلامية غير المختزلة مميزة عن α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية (الشكل 3 أ ، الممرات 1 و 2). في ظل هذه الظروف ، لم تهاجر أي من الوحدات الفرعية المسمى α7 الأيضي إلى الموضع المتوقع عند 60 كيلو دالتون (Couturier et al. 1990 Schoepfer et al. 1990). بدلاً من ذلك ، هاجرت الوحدات الفرعية α7 كمجموعات ، أي في كتلة عريضة بأوزان جزيئية أعلى بكثير. المسمى الأيضي α7 / 5HT3 على النقيض من ذلك ، هاجرت الوحدات الفرعية بالوزن الجزيئي المتوقع لمونومر ∼60-kD ، على الرغم من أن بعضًا من α7 / 5HT المسمى3 تهاجر الوحدات الفرعية أيضًا كمجموعات. الاختلافات في هجرة المسمى α7 / 5HT3 والوحدات الفرعية α7 في ظل هذه الظروف تشير إلى أن الوحدتين الفرعيتين تختلفان في حالة الأكسدة والاختزال.

ينتج تجميع الوحدة الفرعية عن الترابط ثنائي الكبريتيد للوحدات الفرعية نظرًا لعدم وجود α7 أو α7 / 5HT3 لوحظ تكتلات الوحدات الفرعية عند اختزال المواد الهلامية (الشكل 3 أ ، الممران 3 و 4) ، وتعمل الوحدات الفرعية في الغالب كمونومرات عند -60 كيلو دالتون. يشير التوزيع الواسع جدًا للركام على المواد الهلامية غير المختزلة أيضًا إلى أن الوحدات الفرعية عبارة عن ثنائي كبريتيد مرتبط عشوائيًا ببروتينات أخرى ، وكذلك مع بعضها البعض. بشكل مفاجئ ، تم منع تجميع الوحدات الفرعية α7 إذا تمت إضافة NEM أثناء إذابة الوحدات الفرعية (الشكل 3 ج) أو حتى إذا تعرضت الخلايا السليمة لفترة وجيزة لتركيزات NEM منخفضة تصل إلى 100 ميكرومتر قبل الذوبان (الشكل 3 ب). لكي تمنع الألكلة تجميع الوحدات الفرعية المرتبطة بثاني كبريتيد ، يجب أن تحتوي الوحدات الفرعية α7 على مجموعات سلفهيدريل حرة يمكن أن تتألكل قبل تجميع الوحدة الفرعية. نظرًا لأن الركام الوحيدي يتم منعه بواسطة ألكلة الوحدة الفرعية ، فإننا نستنتج أن الركام غير موجود في الجسم الحي ويجب أن يتشكل أثناء الذوبان. علاوة على ذلك ، فإن مجموعات السلفهيدريل الخالية من الوحدة الفرعية α7 التي يمكن أن تتألكل في الخلايا السليمة يتم منعها بطريقة ما من تكوين روابط ثاني كبريتيد ، ويتم إزالة هذه العقبة أثناء الذوبان. تجميع α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية ، التي حدثت بدرجة أقل من تجميع الوحدات الفرعية α7 (الشكل 3 أ) ، تم منعها أيضًا بواسطة ألكلة الوحدات الفرعية باستخدام NEM (الشكل 3 D و 4 B).

بالإضافة إلى الركام ومونومرات الوحدات الفرعية الموجودة على المواد الهلامية ، α7 و α7 / 5HT3 ركضت الوحدات الفرعية كسلم ذي نطاقات ذات وزن جزيئي أعلى حيث كانت كل درجة من مضاعفات المونومر (الشكل 3 أ ، الشكل ج ، والشكل د). ولوحظت نطاقات مقابلة لثنائيات الوحدة الفرعية ، ومقلدات ، ورباعية ، وخماسية ، ولكن لم تكن هناك معقدات أكبر من خماسيات (انظر الشكل 4 ، الشكل 5 ، الشكل 6). تتوافق هذه البيانات مع الوحدات الفرعية α7 المعقدة في خماسيات ، على غرار α7 / 5HT3 مستقبلات الوحدة الفرعية (Rangwala et al. 1997) وغيرها من مستقبلات AChRs المميزة (Karlin and Akabas 1995). بالنسبة للوحدات الفرعية α7 ، كان عددًا كبيرًا من المالتيمرات موجودًا حتى عند اختزال المواد الهلامية أو تمت معالجتها بـ NEM ، على الرغم من أن الألكلة أدت إلى تشتيت بعض الوحدات المتعددة الأكبر حجمًا (الشكل 3 ج). نظرًا لأن معظم مولدات α7 ظلت مرتبطة ارتباطًا وثيقًا حتى في وجود SDS ، فيجب ربطها معًا بواسطة روابط مقاومة SDS بالإضافة إلى أي روابط ثاني كبريتيد. α7 / 5HT3 لوحظ أيضًا مولدات للوحدات الفرعية وبقي معظمها سليمًا عند تقليل المواد الهلامية أو بعد ألكلة NEM (الشكل 3 أ و 4 ب). تشبه هذه الارتباطات المقاومة لـ SDS بين الوحدات الفرعية تلك التي لوحظت بالنسبة لبروتينات قليلة القسيمات الأخرى مثل الوحدات الفرعية لقناة K + (Cortes and Perozo 1997). α7 / 5HT3 تم تشتيت مولدات الوحدة الفرعية ، المترسبة براتنج Bgt التقارب ، بعد ألكلة NEM واختزالها (الشكل 3 د). وبالتالي ، كان هناك فقدان في ارتباطات الوحدة الفرعية المقاومة لـ SDS بعد ظهور مواقع ربط Bgt على α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية.

تم إجراء مجموعة مماثلة من التجارب باستخدام بناء الوحدة الفرعية α7 الذي تم اقتطاعه قبل مجال الغشاء الأول (Tα7-HA الشكل 1 أ). تتجمع هذه الوحدات الفرعية α7 المقتطعة في مجمعات خماسية ، وتربط نسبة صغيرة من الوحدات الفرعية كلاً من Bgt والمنبهات (Wells et al. 1998). تم تصنيف الوحدات الفرعية المقطوعة بشكل استقلابي بعد التعبير العابر في خلايا tsA201 والمناعة باستخدام مضاد HA mAb. من نواحٍ عديدة ، كانت حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية المقتطعة مشابهة لتلك الخاصة بالوحدات الفرعية α7 كاملة الطول في ظل ظروف مماثلة. على المواد الهلامية غير المختزلة في حالة عدم وجود ألكلة NEM ، انتقلت معظم الوحدات الفرعية المقتطعة كمجموعات (الشكل 3 هـ ، الممر 1). مع أو بدون NEM في المخزن المؤقت للذوبان ، لوحظ وجود وحدات متعددة الوحدات الفرعية تتوافق مع مونومرات الوحدة الفرعية المقطوعة من خلال الخماسيات (الشكل 3 E ، الممرات 1 و 2 الشكل 3 F). نظرًا لأن كل من مجاميع الوحدات الفرعية المقطوعة والمتعددة كانت غائبة في تقليل المواد الهلامية (الشكل 3 هـ ، الممر 3) ، نتجت المجاميع والمتعددة عن روابط ثاني كبريتيد بين الوحدات الفرعية. تشير قدرة الوحدات الفرعية α7 المقطوعة على تكوين مجاميع ومتعددة مرتبطة بثاني كبريتيد مماثلة للوحدات الفرعية α7 كاملة الطول إلى أن رابطة ثاني كبريتيد تحدث بين NH خارج الخلية2-المجالات الطرفية للوحدات الفرعية. وتجدر الإشارة أيضًا إلى وجود اختلافات بين الوحدات الفرعية α7 المقتطعة والكاملة الطول. على المواد الهلامية غير المختزلة في غياب ألكلة NEM ، هاجرت بعض الوحدات الفرعية المقتطعة كمونومرات. بالإضافة إلى ذلك ، اختفت الوحدات المتعددة للوحدات الفرعية المقطوعة تمامًا عند اختزال المواد الهلامية (الشكل 3 هـ ، الممر 3) ، وبالتالي لم تعرض الارتباطات المقاومة لـ SDS للوحدات الفرعية α7 كاملة الطول.

تشكيل رابطة ثاني كبريتيد والتغيير في α7 / 5HT3 حالة الوحدة الفرعية للاختزال

على الرغم من أن مجاميع الوحدات الفرعية عبارة عن قطع أثرية للذوبان ، يمكن استخدام مظهرها كمقايسة لـ α7 و α7 / 5HT3 حالة الأكسدة والاختزال للوحدة الفرعية. تم تمييز الخلايا التي تعبر عن أي من الوحدة الفرعية لفترة وجيزة عن طريق الأيض وتم تقييم حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية في أوقات مختلفة بعد وضع العلامات (الشكل 4 أ والشكل ب). مباشرة بعد تخليق الوحدة الفرعية ، كانت الوحدات الفرعية α7 في حالة أدت إلى تكتلات الوحدات الفرعية أثناء الذوبان وظلت في تلك الحالة بعد التوليف (الشكل 4 أ). تقريبًا كل كاميرا α7 / 5HT3 كانت الوحدات الفرعية أيضًا في مجاميع على المواد الهلامية بعد تركيبها (الشكل 4 ب ، الجيل الثاني ، الممر 2). ومع ذلك ، على عكس الوحدات الفرعية α7 ، هناك جزء صغير من α7 / 5HT3 ظهرت الوحدات الفرعية على شكل مونومرات على الهلام وبالتالي كانت في حالة الأكسدة والاختزال المختلفة. رقم α7 / 5HT3 زادت مونومرات الوحدة الفرعية بمرور الوقت بينما انخفض عدد وحدات الوحدات الفرعية حتى معظم α7 / 5HT3 هاجرت الوحدات الفرعية كمونومرات. بناءً على هذه النتائج ، نستنتج أن α7 و α7 / 5HT3 تكون الوحدات الفرعية في حالة الأكسدة والاختزال المماثلة فورًا بعد تخليق الوحدة الفرعية. تنشأ الاختلافات التي لوحظت بين هذه الوحدات الفرعية بمرور الوقت وتنتج عن أحداث المعالجة التي تحول α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية من حالة الأكسدة والاختزال حيث يتم تجميع الوحدات الفرعية إلى الحالة التي تهاجر فيها الوحدات الفرعية كمونومرات على المواد الهلامية.

لاختبار ما إذا كانت روابط ثاني كبريتيد تتشكل على α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية أثناء التغيير في حالة الأكسدة والاختزال للوحدة الفرعية ، تم تطبيق العامل المختزل ، DTT ، على الخلايا بعد وضع العلامات الأيضية للوحدات الفرعية (الشكل 4 ج). عند إضافته إلى وسط الثقافات ، يتخلل DTT الخلايا ويمنع تكوين روابط ثاني كبريتيد البروتين في ER وكذلك يقلل من روابط ثاني كبريتيد الموجودة دون تغيير معظم الوظائف الخلوية الأخرى (Braakman et al. 1992). بعد إضافة 5 ملي مولار DTT ، α7 / 5HT3 بقيت الوحدات الفرعية كمجموعات على المواد الهلامية وتم حظر كل التحويلات اللاحقة إلى المونومرات (الشكل 4 ج). لاحظ أن العدد القليل من المونومرات التي لوحظت في الشكل 4 ج توجد أثناء النبضة عندما لا يوجد DTT ولا تزداد بعد إضافة DTT. لذلك ، أدت إضافة 5 ملي مولار من DTT إلى وسط الخلية بعد تسمية الوحدات الفرعية إلى منع التغيير في α7 / 5HT3 حالة الأكسدة والاختزال للوحدة الفرعية. كان تأثير DTT قابلاً للعكس. إذا تمت إزالة DTT من الوسط ، α7 / 5HT3 تم تحويل مجاميع الوحدات الفرعية مرة أخرى إلى α7 / 5HT أحادي3 تشابه الوحدة الفرعية مع الوقت (البيانات غير معروضة). بناءً على هذه البيانات ، نستنتج أن روابط ثاني كبريتيد تتشكل على α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية أثناء التغيير في حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية. كاميرا α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية ، التي تنتج عن تغيير حالة الأكسدة والاختزال ، تهاجر كمونومرات وحدة فرعية على المواد الهلامية غير المختزلة باستثناء الوحدات المتعددة الوحدات الفرعية التي تتشكل أثناء الذوبان في غياب ألكلة الوحدة الفرعية (انظر الشكل 3 د). روابط ثاني كبريتيد التي تتشكل أثناء تغير حالة الأكسدة والاختزال هي روابط داخل الوحدة الفرعية.

يتزامن تكوين موقع ربط Bgt مع التغيير في α7 / 5HT3 حالة الوحدة الفرعية للاختزال

منذ تشكل مواقع ربط Bgt على α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية وليس على الوحدات الفرعية α7 (الشكل 1 B Cooper and Millar 1997 Rangwala et al. 1997) ، قمنا باختبار ما إذا كان تكوين موقع ربط Bgt يرتبط بالتغيير في α7 / 5HT3 حالة الأكسدة والاختزال للوحدة الفرعية. لمراقبة تشكيل موقع ربط Bgt ، قسامات متساوية من α7 / 5HT المسمى3 تم ترسيب الوحدات الفرعية باستخدام Bgt-Sepharose أو مع مضاد HA mAb في أوقات مختلفة بعد تسمية الوحدات الفرعية (الشكل 5 أ). توجد علاقة قوية بين ظهور الوحدات الفرعية المترسبة Bgt-Sepharose والتغير في حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية كما تم فحصها بواسطة مونومرات الوحدة الفرعية المترسبة مع مضادات HA mAb. عجل Bgt-Sepharose تقريبًا جميع α7 / 5HT3 مونومرات الوحدة الفرعية وكميات أصغر من α7 / 5HT3 مجاميع الوحدة الفرعية. علاوة على ذلك ، فإن الدورة الزمنية لتشكيل موقع ربط Bgt وظهور α7 / 5HT3 لا يمكن تمييز مونومرات الوحدة الفرعية.

اختبرنا أيضًا ما إذا كان تشكيل موقع ربط Bgt محظورًا عن طريق إضافة DTT بعد وسم الوحدة الفرعية. مرة أخرى ، تمت إضافة 5 ملي مولار DTT إلى وسط الخلايا الذي يحتوي على α7 / 5HT3 تم تسمية الوحدات الفرعية. أدى وجود DTT إلى منع تكوين مواقع ربط Bgt كما يتضح من عدم وجود وحدات فرعية مترسبة إضافية من Bgt-Sepharose بعد تطبيق DTT على الوسط (الشكل 5 ب). لذلك ، رابطة ثنائي كبريتيد داخل الوحدة الفرعية لـ α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية مطلوبة أيضًا لتكوين موقع ربط Bgt. من الواضح أن تكوين موقع ربط Bgt وتغيير حالة الأكسدة والاختزال هما حدثان مرتبطان ارتباطًا وثيقًا أثناء α7 / 5HT3 تجميع المستقبلات كما هو موضح في كتلة كلا الحدثين بواسطة DTT وارتباطهما الوثيق في الوقت المناسب.

Α7 و α7 / 5HT3 تحتوي مجمعات ربط Bgt على وحدات فرعية في حالات مختلفة من الأكسدة والاختزال

على الرغم من وجود علاقة قوية بين ظهور مونومرات الوحدة الفرعية على المواد الهلامية وتشكيل مواقع ربط Bgt ، إلا أن Bgt-Sepharose أدى أيضًا إلى ترسيب مجاميع فرعية ووحدات متعددة (الشكل 5 أ و 3 د). تشير هذه النتيجة إلى أن α7 / 5HT ملزم لـ Bgt3 تحتوي المستقبلات على α7 / 5HT3 الوحدات الفرعية في كلتا حالات الأكسدة والاختزال. لمزيد من اختبار ما إذا كانت كلا المطابقتين موجودة داخل المستقبل ، قمنا بعزل Bgt-ملزم للسطح α7 / 5HT3 مستقبلات. لقد أوضحنا سابقًا أن المستقبلات السطحية عبارة عن مجموعة موحدة من الخماسيات ذات الكتلة الجزيئية 260 كيلو دالتون وأن جميع المستقبلات مرتبطة بشكل تعاوني ناهض (رانجوالا وآخرون 1997). ارتبطت الخلايا السليمة بـ Bgt الخالي من الخلايا ، وتم ترسيب المستقبلات المرتبطة بـ Bgt بأجسام مضادة لـ Bgt لعزل المستقبلات السطحية على وجه التحديد. تم تحليل الوحدات الفرعية المسمى على المواد الهلامية غير المختزلة وتمت مقارنة الوحدات الفرعية المذابة في غياب أو وجود NEM (الشكل 6 أ). في حالة عدم وجود NEM ، لوحظت مجاميع الوحدات الفرعية والمتعددة جنبًا إلى جنب مع مونومرات الوحدة الفرعية. عندما تمت الألكلة باستخدام NEM ، تم تشتيت المجاميع والمتعددة ، مما أدى إلى زيادة عدد مونومرات الوحدة الفرعية على الجل. نظرًا لأن مستقبلات السطح تتكون من مجموعة متجانسة من الخماسيات ، فإننا نستنتج أن المستقبلات السطحية تحتوي على وحدات فرعية في كل من مطابقة الأكسدة والاختزال. توضح الزيادة المزدوجة تقريبًا في المونومرات مع ألكلة NEM أن عددًا كبيرًا من α7 / 5HT3 تم العثور على الوحدات الفرعية في Bgt ، والمستقبلات السطحية في كلتا حالات الأكسدة والاختزال.

تم استخدام خطوط الخلايا PC12 و SH-SY5Y للنظر في معالجة الوحدات الفرعية α7 في الخلايا التي تنتج مستقبلات α7 وظيفية وملزمة لـ Bgt. تحتوي خلايا PC12 على مستقبلات داخلية مرتبطة بـ Bgt تحتوي على وحدات فرعية α7 (Blumenthal et al. 1997 Rangwala et al. 1997) بينما تعبر خلايا SH-SY5Y بثبات عن الوحدات الفرعية للجرذ α7 بالإضافة إلى الوحدات الفرعية الذاتية α7 (Peng et al. 1994 Puchacz et آل 1994). تفتقر الوحدات الفرعية α7 في خطوط الخلايا هذه إلى حاتمة HA ومستوى تخليق الوحدة الفرعية ليس مرتفعًا مثل المستوى الذي تحققه تعداء عابر. منعتنا هذه الاختلافات من توصيف الوحدات الفرعية α7 في خطوط الخلايا هذه بنفس درجة α7-HA و α7 / 5HT3-وحدات HA في خلايا tsA201. ومع ذلك ، تمكنا من تعجيل الوحدات الفرعية α7 من خلايا SH-SY5Y و PC12 باستخدام Bgt-Sepharose وإجراء تحليل لطخة غربية على الوحدات الفرعية α7 من كلا خطوط الخلايا (الشكل 6 ب والشكل ج). كانت معالجة الوحدات الفرعية α7 في خلايا SH-SY5Y و PC12 مختلفة عن تلك الخاصة بالوحدات الفرعية α7 في خلايا tsA201. في حالة عدم وجود ألكلة NEM ، هاجرت العديد من الوحدات الفرعية α7 في هذه الخلايا كمونومرات على هلام غير مخفض (الشكل 6 ب والشكل ج ، الممر 1). لم يتم ملاحظة مثل هذه المونومرات مطلقًا على المواد الهلامية غير المختزلة مع التعبير عن الوحدات الفرعية α7-HA في خلايا tsA201. بالإضافة إلى المونومرات ، كانت هناك مجاميع فرعية ومتعددة. مثل α7 / 5HT ملزم Bgt3 تم تفريق الوحدات الفرعية في خلايا tsA201 (الشكل 3 د) ، الوحدات الفرعية α7 ، المترسبة براتنج تقارب Bgt ، بواسطة ألكلة NEM والاختزال (الشكل 6 ب والشكل ج ، الممر 2). تم العثور على نتائج مماثلة لـ PC12 BgtRs على سطح الخلية معزولة على وجه التحديد عن طريق ربط Bgt بالخلايا السليمة والمناعة المناعية للمستقبلات المرتبطة بـ Bgt مع الأجسام المضادة لـ Bgt (الشكل 6 C ، الممرات 4 و 5).

تختلف الوحدات الفرعية α7 المعزولة من خلايا SH-SY5Y و PC12 عن α7 و α7 / 5HT3 الوحدة الفرعية من خلايا tsA201 حيث هاجرت الوحدات الفرعية كمزدوجة بعد ألكلة NEM على تقليل المواد الهلامية (الشكل 6 B ، الممر 2 ، و C ، الممرات 2 و 4). يتم التعرف على كلا النطاقات المزدوجة بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بـ α7 على البقع الغربية ، وبالتالي فهي أشكال مختلفة للوحدة الفرعية α7. في ظل نفس الظروف ، يتم أيضًا ملاحظة النطاقات المزدوجة مع الوحدات الفرعية المسمى استقلابيًا (البيانات غير معروضة). تم ترحيل النطاق السفلي للمزدوج بدقة في نفس الموضع مثل نطاق مونومر الوحدة الفرعية α7-HA المعبر عنه بـ tsA201 (الشكل 6 ب والشكل ج ، الممر 3). لذلك ، يتوافق النطاق السفلي مع شكل الوحدة الفرعية α7 الذي لوحظ في خلايا tsA201 ، والذي ينتقل في هذا الموضع فقط عندما تمنع ألكلة NEM تجميع ثاني كبريتيد والربط المتبادل. ينتقل النطاق العلوي بشكل أبطأ بعد الألكلة مما هو عليه عندما يكون غير مؤكل (الشكل 6 B ، الممر 1 ، و C ، الممران 1 و 5) ، ويفترض أنه في الحالة التوافقية الثانية. من المهم أن نلاحظ أن α7 لوحظ مزدوج الوحدة الفرعية في ظل ظروف من شأنها أن تقضي على أي اختلاف في حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية ، أي ألكلة NEM وهلام مختزل. يشير وجود نطاقي وحدات فرعية α7 في ظل هذه الظروف إلى أن الوحدات الفرعية α7 في هذه الخلايا تتميز بأكثر من اختلاف في حالة الأكسدة والاختزال للوحدات الفرعية.


التمويل

تم دعم هذا العمل من قبل Fonds de recherche du Qu & # x00E9bec & # x2013 Sant & # x00E9 ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2017-04790) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP 123389) ، و مؤسسة J.-Louis L & # x00E9vesque إلى JW. أصبحت هذه الدراسة ممكنة أيضًا من خلال منحة جماعية من مؤسسة العلوم الوطنية في الصين (# 81361120264) إلى J-ZS و S-JH و TW و JW ، ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (# 81700363) إلى YW.


مقدمة

متلازمات الوهن العضلي الخلقي (CMS) هي اضطرابات غير متجانسة مرتبطة بضعف العضلات المرهق بسبب هامش الأمان الضعيف للانتقال العصبي العضلي. في الوقت الحاضر ، تم تحديد ما لا يقل عن 33 جينًا لمرض CMS. 1-3 تؤثر المتغيرات التي تم تحديدها على التطور ، والاستقرار ، أو قدرة نقل الإشارة للموصل العصبي العضلي. ما يقرب من نصف CMS التي تم تحديدها ناتجة عن طفرات في وحدات فرعية مختلفة من مستقبلات الأسيتيل كولين (AChR).

AChR عبارة عن قناة أيون كاتيون خماسية بوابات ليجند تتكون من وحدات فرعية متماثلة مع قياس العناصر المتكافئة (α1)2β1δε. يحتوي كل مستقبل على موقعين للربط ، موقع شديد التقارب يتكون بين الوحدات الفرعية α- و ، وموقع تقارب منخفض بين الوحدات الفرعية α- و. تشكل الوحدة الفرعية α الوجه الرئيسي لكل موقع ربط ، وتشكل الوحدتان الفرعيتان و الوجه التكميلي. تحتوي كل وحدة فرعية على أربعة مجالات عبر الغشاء ، مع مجال الغشاء الثاني (M2) لكل وحدة فرعية تشكل جدار القناة الأيونية. داخل M2 ، تساهم المخلفات الكارهة للماء المحفوظة بين الوحدات الفرعية في بوابة القناة ، ولكن ما إذا كانت البقايا في المواضع المكافئة للوحدات الفرعية تساهم بشكل مكافئ في بوابة القناة لا يزال غير واضح.

يمكن لطفرات وحدات AChR الفرعية أن تقلل من التعبير عن المستقبل على سطح الخلية ، أو تغير حركية تنشيط المستقبل ، أو كليهما. يتم تقسيم CMS مع العيوب الحركية إلى فئتين ، CMS سريع القناة (FCCMS) وقناة بطيئة CMS (SCCMS). يُظهر SCCMS تسوسًا بطيئًا لإمكانيات اللوحة النهائية المصغرة (MEPPs) أو التيارات (MEPCs) إما بسبب فتح القناة لفترة طويلة أو إعادة فتح القناة المتزايدة. 4 أثناء النشاط البدني ، تجمع EPPs لفترات طويلة بطريقة سلم ، مما يؤدي إلى إزالة استقطاب الغشاء بعد المشبكي ويسبب كتلة إزالة الاستقطاب التي تعطل قنوات الصوديوم ذات الجهد الكهربائي. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح EPPs لفترات طويلة بالتدفق المفرط للكالسيوم إلى منطقة ما بعد المشبكي ، مما يؤدي إلى انحطاط بؤري للطيات الوصلة ، وفقدان AChR وموت الخلايا المبرمج للنواة الفرعية ، والتي يشار إليها مجتمعة باسم اعتلال عضلي صفيحة نهائية. 5 علاوة على ذلك ، فإن AChRs من مرضى SCCMS عرضة لإزالة التحسس ، مما يقلل من عدد AChRs المتاحة للتنشيط. 6 حتى الآن ، تم الإبلاغ عن 24 طفرة بطيئة القناة في مجالات مختلفة من وحدات AChR الفرعية ، 7 ولكن تم تحديد طفرتين فقط تتضمن نفس البقايا في الوحدة الفرعية. 8 ، 9 تظهر معظم طفرات القناة البطيئة في المجالات عبر الغشاء للوحدات الفرعية AChR ، ولكن تم إعاقة التحليل التفصيلي لعواقبها الحركية بسبب عدم قدرة أدوات التسجيل على التقاط أسرع خطوات البوابات باستخدام ACh كمنبه. ومن ثم ، فقد تم استخدام الكولين ، وهو ناهض ضعيف يثير معدل فتح القناة أبطأ من ACh ، لدراسة حركية تنشيط طفرات SCCMS. 7 ، 10 ، 11

في هذه الدراسة ، أبلغنا عن مريض لديه طفرة L273F جديدة في المجال M2 من الوحدة الفرعية AChR ، وتقييم آثارها المسببة للأمراض من خلال الدراسات السريرية والمورفولوجية ، وفحص النتائج الحركية للطفرة باستخدام مادة الكولين كمحفز. نقارن أيضًا العواقب الحركية لـ δL273F بتلك الخاصة بطفرة εL269F 12 التي تم الإبلاغ عنها سابقًا والموجودة في موضع مكافئ لموضع δL273F.


المواد والأساليب

الحيوانات.

تم إجراء التجارب على الفئران WT (سلالة C57BL / 6J) ، α4 - / - ، α6 - / - ، α4 - / - × α6 - / - و α4vec nAChR الفئران التي تتراوح أعمارها بين 8-21 أسبوعًا ووزنها 25-35 جم. تم إنشاء α4 - / - و α6 - / - الفئران كما هو موضح سابقًا (مواد وطرق SI والمراجع. 21 و 40).

في الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي: تسجيلات أحادية الخلية خارج الخلية.

تم تخدير الفئران باستخدام هيدرات الكلورال ، 400 مجم / كجم ، مكمل كما هو مطلوب للحفاظ على التخدير الأمثل طوال التجربة ، وتم وضعها في إطار تجسيمي (David Kopf). تم الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية عن طريق بطانية تسخين يتم التحكم فيها حرارياً. تم إدخال قسطرة في الوريد الصافن لجميع الحيوانات من أجل IV. إدارة النيكوتين. تم وصف إجراءات التسجيل الكهربية لخلية DA مسبقًا (14). بعد تسجيل خط الأساس لمدة 15-30 دقيقة ، تم حقن 10 ميكرولتر من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) في الوريد. في الوريد الصافن ، وبعد 3-5 دقائق ، تم إعطاء النيكوتين (30 ميكروغرام / كجم) في الوريد. استندت الجرعة إلى دراسات سابقة أظهرت أن النيكوتين يمكن أن يكون وراثيًا. يتم تناوله ذاتيًا عند هذه الجرعة في الفئران (41).

تحديد خلية DA

استند التعرف خارج الخلية على الخلايا العصبية DA على موقعها وكذلك على مجموعة الخصائص الكهربية الفريدة التي تميز هذه الخلايا في الجسم الحي (مواد وطرق SI). قمنا أيضًا بتسمية بعض الخلايا بالبيوتين العصبي (الشكل 3ب) لحساب خطر سوء تصنيف خلية غير DA على أنها دوبامين (مواد وطرق SI).

تحضير الشرائح وقياس الجهد.

تم تحضير شرائح المخطط التاجي ، بسمك 300 ميكرون ، والتي تحتوي على كل من NAc و CPu من دماغ الفئران من مختلف الأنماط الجينية باستخدام الطرق الموصوفة مسبقًا (17 ، 42). [DA]ا تمت مراقبته عند 32 درجة مئوية في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المخزن بالبيكربونات (يحتوي على 2.4 ملي مولار Ca 2+) باستخدام قياس الفولتميتر الدوري سريع المسح باستخدام أقطاب دقيقة من ألياف الكربون بحجم 10 ميكرومتر (طول طرف -50-100 ميكرومتر ، مُصنع داخليًا) و أ ميلار فولتاميتر (أنظمة PD) كما هو موضح سابقًا (17 ، 42). باختصار ، كان جهد المسح عبارة عن شكل موجة مثلث (0.7 V إلى + 1.3V مدى مقابل Ag / AgCl) بمعدل مسح 800 فولت / ثانية وتردد أخذ العينات 8 هرتز. تُنسب إشارة التيار المستحث إلى DA من خلال مقارنة إمكانات تيارات ذروة الأكسدة والاختزال مع تلك الخاصة بـ DA في وسط المعايرة (+ 500-600 و 200 mV مقابل Ag / AgCl ، على التوالي). تمت معايرة الأقطاب الكهربائية في 2 ميكرومتر DA في الوسائط التجريبية. تم وصف التحفيز الكهربائي للشريحة في مواد وطرق SI.

المخدرات.

تم تحضير محلول النيكوتين للقياسات في الجسم الحي على النحو التالي: تم إذابة 0.5 ملي مولار من طرطرات النيكوتين في محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ وضبط إلى الرقم الهيدروجيني 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. أظهرت دراسة أولية أن i.v. لم يكن لحقن محلول تحكم (0.9٪ كلوريد الصوديوم / 0.5 ملي مولار من طرطرات KNa) أي تأثير على الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للخلايا العصبية DA في حيوانات WT.

ناقل لينتيفيرال.

يتم اشتقاق نواقل التعبير الفيروسي البطيء من نواقل التعبير pHR التي تم وصفها لأول مرة بواسطة Naldini et al. (43) ، مع العديد من التعديلات اللاحقة كما أشار Maskos et al. (8). في الفيروس البطيء المستخدم في هذه الدراسة ، يكون التعبير bicistronic للماوس WT α4 nAChR الوحدة الفرعية (كدنا) و EGFP (كدنا) تحت سيطرة محفز كيناز فسفوغليسيرات الفأر (10). بالنسبة للتجارب مع الفئران α4vec ، كانت عناصر التحكم عبارة عن α4 - / - وحُقنت الفئران WT بفيروس لينتيفيروس يعبر عن EGFP فقط. (ترد تفاصيل الحقن التجسيمي للفيروس البطيء بصيغة مواد وطرق SI.)

125 التصوير الإشعاعي الذاتي I-Epibatidine.

تم تحضين المقاطع التاجية (20 ميكرومتر) في درجة حرارة الغرفة مع 200 ميكرومتر 125 I-epibatidine (Perkin-Elmer) (نشاط محدد 2،200 Ci / mmole) (Perkin-Elmer) في 50 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4 ، لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تم شطف المقاطع مرتين لمدة 5 دقائق في نفس المخزن المؤقت ولفترة وجيزة في الماء المقطر. ثم تم تعريض الأقسام لأفلام Kodak Biomax طوال الليل.

بروتوكول الإدارة الذاتية.

لتقييم تأثيرات التعزيز للنيكوتين ، استخدمنا نموذج الماوس الموصوف مسبقًا لـ ICSA (8 ، 44). يعتمد هذا النموذج على مهمة تمييز متاهة Y بين ذراع معززة بالنيكوتين وذراع محايدة (مواد وطرق SI).

تحليل احصائي.

تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام لغة R ، وهي بيئة للحوسبة الإحصائية (http://www.r-project.org).

قياس نمط إطلاق النار.

تم تحليل إطلاق خلية DA في الجسم الحي فيما يتعلق بمتوسط ​​معدل إطلاق النار والنسبة المئوية للارتفاعات داخل انفجار (مواد وطرق SI). لتقدير تأثير النيكوتين ، تم إعادة قياس نشاط كل خلية من خلال متوسط ​​قيمتها الأساسية خلال 2.5 دقيقة قبل حقن النيكوتين. استخدمنا اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون غير معلمي مزدوج لمقارنة معدل إطلاق النار و٪ SWB قبل وبعد حقن النيكوتين. تم استخدام اختبارات Wilcoxon غير المزدوجة لمقارنة معدل إطلاق النار و٪ SWB في مجموعتين من السكان (مواد وطرق SI).

كشف الفولتميتر من الدوبامين.

يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SEM ، وحجم العينة ، ن، هو عدد الملاحظات. تمثل كل مجموعة بيانات نتائج من ثلاثة حيوانات أو أكثر. تم تقييم مقارنات الاختلافات في الوسائل عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه ، مقارنة متعددة لاحقة ر الاختبارات (Bonferroni) ، أو unpaired ر الاختبارات باستخدام GraphPad Prism. تم إجراء تركيب المنحنى والانحدار الخطي في GraphPad Prism أو SigmaPlot.


شاهد الفيديو: المستقبلات المرتبطة إلى أنظيمات نظرة عامة (كانون الثاني 2022).